وصف
هييف NGSالعلامة التجارية مجموعة تحضير مكتبة OnePot Pro DNA V3 هي مجموعة تحضير مكتبة تعتمد على التجزئة الأنزيمية من الجيل الجديد تم تطويره وتصميمه خصيصًا لـ إلومينا منصة تسلسل MGI. بالمقارنة مع طرق بناء المكتبة التقليدية، يستخدم هذا المنتج إنزيمات تجزئة عالية الجودة، مما يلغي عملية الموجات فوق الصوتية المرهقة. إنه يبسط التشغيل من خلال الجمع بين وحدات التجزئة وإصلاح النهاية في وحدة واحدة. بالإضافة إلى ذلك، يتم خلط الإنزيمات والمحلول العازل لوحدة الربط مسبقًا، مما يقلل بشكل كبير من الوقت وتكلفة بناء المكتبة. هذا يجعلها أكثر ملاءمة لبناء المكتبة الآلية. تتمتع مجموعة إعداد المكتبة هذه بمعدل تحويل مكتبة ممتاز ويمكن تطبيقها على العينات من جميع الحيوانات والنباتات والكائنات الحية الدقيقة الشائعة وما إلى ذلك، بالإضافة إلى عينات FFPE. على أساس الجيل السابق من مجموعة بناء المكتبة، يظهر هذا المنتج كفاءة أعلى في التجزئة، إصلاح النهاية، وربط dA، وربط المحول مقارنة بالإصدارات السابقة. يعمل الإنزيم عالي الدقة على تحسين اتساق ودقة التضخيم بشكل كبير.
تحديد
| رقم القط. | 12194ES08 / 12194ES24 / 12194ES96 |
| مقاس | 8 ت / 24 ت / 96 ت |
عناصر
| المكونات رقم | اسم | 12194ES08 | 12194ES24 | 12194ES96 |
| 12194-أ | سميرازالعلامة التجارية المخزن المؤقت 3.0 | 80 ميكرولتر | 240 ميكرولتر | 960 ميكرولتر |
| 12194-ب | سميرازالعلامة التجارية إنزيم 3.0 | 80 ميكرولتر | 240 ميكرولتر | 960 ميكرولتر |
| 12194-ج | خلطة جاهزة للربط | 200 ميكرولتر | 600 ميكرولتر | 3×800 ميكرولتر |
| 12194-د | 2 × مزيج تضخيم Ultima HF | 200 ميكرولتر | 600 ميكرولتر | 3×800 ميكرولتر |
[ملحوظة]: مكونات المجموعة متوافقة مع كليهما إلومينا &MGI منصة التسلسل، إذا كان المحول كاملا تم استخدامه هييف NGSالعلامة التجارية مزيج التمهيدي (Yeasen Cat#12190 أو Cat#12191) مطلوب.
تخزين
يجب تخزين هذا المنتج في درجة حرارة -25~-15 درجة مئوية لمدة 1 سنة.
ملحوظات
1. حول العملية
1. يرجى العمل مرتديًا معاطف المختبر والقفازات التي تستخدم لمرة واحدة،من أجل سلامتك.
2. قم بتذويب المكونات في درجة حرارة الغرفة. بعد إذابة الثلج، قم بخلط المكونات جيدًا باستخدام الدوامة، ثم قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة ثم ضعه على الثلج لاستخدامه لاحقًا.
3. عند تحضير محلول التفاعل لكل خطوة، يوصى باستخدام ماصة لخلط المحلول جيدًا أو رجّه برفق. قد يؤدي الرج القوي إلى انخفاض إنتاج المكتبة.
4. يوصى بشدة باستخدام أطراف الماصة المفلترة لتجنب التلوث المتبادل. تأكد من تغيير أطراف الماصة عند معالجة عينات مختلفة.
5. من المحتمل جدًا أن تتسبب العمليات غير السليمة في تلوث الهباء الجوي، مما يؤثر على دقة النتيجة. يوصى بالعزل المادي الإلزامي لمناطق خلط تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ومناطق تحليل تنقية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل. مجهز بمعدات مثل الماصات المتخصصة لبناء المكتبة. قم بإجراء التنظيف الروتيني لكل منطقة عن طريق مسح الأسطح بمحلول هيبوكلوريت الصوديوم 0.5٪ أو مبيض 10٪
6. هذا المنتج مخصص للاستخدام البحثي فقط.
2. تجزئة الحمض النووي
1. الطقم متوافق مع 100 صفحة - 1000 نانوجرام من الحمض النووي المدخل. يوصى بشدة باستخدام الحمض النووي المدخل عالي الجودة مع A260/A280 = 1.8-2.0.
2. قد تتأثر التجارب التالية إذا تم إدخال تركيزات عالية من الأملاح مثل عامل استخلاب المعدن مع الحمض النووي المدخل. نوصي بغسل عينة الحمض النووي في دي دي اتش2ا للتجزئة.
3. يرجى الرجوع إلى الجدول 6 لوقت تفتيت عينات الحمض النووي القياسية. تتميز المجموعة بانحياز تفتيت منخفض وتوفر تغطية موحدة لـ GC لعينات الحمض النووي مع مجموعة واسعة من تركيبات GC. يرجى ضبط وقت التجزئة بناءً على متطلباتك التجريبية.
4. للحصول على تجزئة دقيقة، يرجى تحضير التفاعل على الجليد.
3. ربط المحول
1. تتوفر مجموعات المحولات الطويلة (المحولات الشريطية) ومجموعات المحولات القصيرة من Illumina أو MGI للعملاء للاختيار وفقًا لمتطلباتهم التجريبية.
2. يوصى باختيار محولات تجارية عالية الجودة. إذا تم اختيار محولات ذاتية الصنع، فيرجى تكليف شركة ذات خبرة في تصنيع برايمر NGS والإشارة إلى الحاجة إلى التحكم الصارم في التلوث. بالإضافة إلى ذلك، يوصى بإعداد محلول التلدين DNA في مقعد نظيف وتشغيل نوع واحد فقط من المحولات في كل مرة لمنع التلوث المتبادل.
3. يرجى إذابة المحولات على الجليد أو عند 4 درجات مئوية؛ عند التشغيل في درجة حرارة الغرفة، يجب ألا تتجاوز درجة حرارة المختبر 25 درجة مئوية لمنع المحولات من التحلل.
4. ستؤثر جودة وتركيز المحولات بشكل مباشر على كفاءة الربط وعائد المكتبة. يؤدي التركيز العالي جدًا للمحولات إلى تكوين ثنائي المحولات بينما يؤدي تركيز المحول القليل جدًا إلى تقليل معدل الربط وعائد المكتبة. التخفيفات المقابلة باستخدام TE Buffer وفقًا لكمية DNA المدخلة عند استخدام المحول. الجدول 1-2 يسرد طرق التخفيف الموصى بها للمحولات التقليدية ومحولات UMI لكميات مختلفة من الحمض النووي المدخل باستخدام هذه المجموعة لمنصات التسلسل Illumina أو MGI.
طاولة 1 المنتج الموصى به Illumina كمية المحول للمدخلات المختلفة الحمض النووي
| مدخل الحمض النووي | جنسبة التخفيف للمحول التقليدي | تركيز | نسبة تخفيف محول UMI | تركيز |
| ＜1 نانوغرام | 7.5 أضعاف | 2 ميكرومتر | 15 طية | 1 ميكرومتر |
| 1 نج ~ 10 نانوغرام | 3 أضعاف | 5 ميكرومتر | 3 أضعاف | 5 ميكرومتر |
| 10 نج ~ 200 نج | 1.5 أضعاف | 10 ميكرومتر | 2-طي | 7.5 ميكرومتر |
| ＞200 نانوغرام | 0-طي | 15 ميكرومتر | 0-طي | 15 ميكرومتر |
طاولة 2 الموصى به إم جي آي كمية المحول للمدخلات المختلفة الحمض النووي
| مدخل الحمض النووي | جنسبة التخفيف للمحول التقليدي | تركيز | نسبة تخفيف محول UMI | تركيز |
| ＜1 نانوغرام | 5 أضعاف | 2 ميكرومتر | 10 أضعاف | 1 ميكرومتر |
| 1 نج ~ 10 نانوغرام | 2-طي | 5 ميكرومتر | 2-طي | 5 ميكرومتر |
| 10 نج ~ 200 نج | 0-طي | 10 ميكرومتر | 1.25 أضعاف | 8 ميكرومتر |
| ＞200 نانوغرام | 0-طي | 10 ميكرومتر | 0-طي | 10 ميكرومتر |
4. تنظيف الحمض النووي واختيار الحجم بناءً على الخرز
1. يمكن إجراء اختيار حجم الحمض النووي قبل إصلاح النهاية/الذيل dA، أو بعد ربط المحول، أو بعد التضخيم.
2. يوصى بإجراء اختيار الحجم مباشرة بعد ربط المحول إذا كانت كمية الحمض النووي المدخلة أكبر من 50 نانوجرام؛ بخلاف ذلك، يرجى إجراء اختيار الحجم بعد التضخيم.
3. يحتوي مُعزز الربط على تركيز عالٍ من PEG، والذي قد يسبب تأثيرًا كبيرًا على دقة اختيار الحجم. وبالتالي، إذا كان من المقرر إجراء اختيار الحجم مباشرة بعد ربط المحول، فمن المستحسن بشدة إضافة خطوة تنظيف الخرز قبل اختيار الحجم. يمكن إجراء خطوة اختيار الحجم مباشرة إذا تم إجراؤها قبل الإصلاح النهائي/dA-tailing أو بعد تضخيم المكتبة.
4. يجب موازنة الخرز المغناطيسي عند درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام، وإلا فإن العائد سوف ينخفض وسوف يتأثر تأثير اختيار الحجم.
5. يجب خلط الخرز المغناطيسي جيدًا باستخدام الدوامة أو الماصة قبل الاستخدام.
6. لا تقم بشفط الخرز عند نقل السائل العلوي، فحتى الكميات الضئيلة من الخرز قد تؤثر على التفاعلات التالية.
7. يجب تحضير 80% من الإيثانول طازجًا، وإلا فسوف يؤثر ذلك على كفاءة الاسترداد.
8. لاختيار الحجم بدقة، يوصى بالبدء بحجم أكبر من 100 ميكرولتر. إذا كان أقل، يوصى بزيادة الحجم إلى 100 ميكرولتر باستخدام ماء فائق النقاء.
9. يجب تجفيف الخرز المغناطيسي في درجة حرارة الغرفة قبل استخلاص المنتج. سيؤدي الجفاف غير الكافي بسهولة إلى تأثر التفاعلات اللاحقة ببقايا الإيثانول؛ سيؤدي الجفاف المفرط إلى تشقق الخرز المغناطيسي وتقليل عائد التنقية. عادةً، يكون التجفيف في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-5 دقائق كافيًا للسماح للخرز بالجفاف تمامًا.
10. إذا لزم الأمر، يتم غسل عينات الحمض النووي المنقاة أو المختارة حسب الحجم في 0.1× يمكن تخزين محلول TE عند 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أسبوع أو عند -20 درجة مئوية لمدة شهر.
5. تضخيم المكتبة
1. يعتمد إجراء تضخيم المكتبة من عدمه على كمية الحمض النووي المدخل وأنواع المحولات وتطبيقات بيانات التسلسل وما إلى ذلك. تكون خطوة التضخيم مطلوبة في حالة استخدام محولات جزئية. عند استخدام محولات كاملة الطول، إذا كان الحمض النووي المدخل <200 نانوجرام، فمن المستحسن إجراء التضخيم؛ وإلا فلن يكون التضخيم ضروريًا.
2. يجب التحكم بشكل صارم في أرقام دورة التضخيم. قد يؤدي التضخيم غير الكافي إلى انخفاض إنتاج المكتبة؛ قد يؤدي التضخيم المفرط إلى زيادة التحيز والأخطاء والقراءة المكررة والمنتجات الكيميرية. الجدول 3 تسرد أرقام الدورة الموصى بها والتي تستهدف إنتاج المكتبة بمقدار 1 ميكروجرام.
طاولة 3 العدد الموصى به من الدورات لتوليد 1000 نانوجرام من غلة المكتبة
| إدخال الحمض النووي | عدد الدورات المطلوبة لتوليد 1 ميكروجرام من إنتاج المكتبة |
| 1000-2000 نج | 2 - 4 |
| 500 نانوغرام | 2 - 4 |
| 250 نانوغرام | 4 - 6 |
| 100 نانوغرام | 5 - 7 |
| 50 نانوغرام | 7 - 9 |
| 10 نانوغرام | 9 - 11 |
| 5 نانوغرام | 10 - 12 |
| 1 نانوغرام | 12 - 15 |
| 100 صفحة | 16 - 18 |
ملحوظة
1. الجدول 3 يظهر عدد معلمات الحلقة باستخدام اختبارات الحمض النووي المدخلة عالية الجودة بحوالي 200 زوج أساسي. تختلف جودة الحمض النووي FFPE بشكل كبير، وعندما تكون جودة الحمض النووي رديئة أو يكون طول المكتبة طويلاً، يجب زيادة عدد الدورات بشكل مناسب للحصول على مكتبات كافية.
2. إذا كان اختيار الحجم مطلوبًا أثناء عملية بناء المكتبة، يوصى برقم دورة أعلى لتضخيم المكتبة؛ وإلا، يوصى برقم دورة أقل.
3. إذا تم استخدام محولات غير كاملة، فمن الضروري تضخيم دورتين على الأقل لتشكيل محول كامل.
6. تحليل جودة المكتبة
1. يتم تحليل جودة المكتبات المُنشأة بشكل عام عن طريق قياس التركيزات وتوزيعات الحجم.
2. يمكن قياس تركيزات المكتبات باستخدام طرق تعتمد على الفلورسنت مثل Qubit وPicoGreen أو qPCR.
3. لا يُنصح باستخدام طرق القياس المعتمدة على الامتصاص مثل NanoDrop.
4. يوصى باستخدام طريقة qPCR لتحديد كمية المكتبة: لا تستطيع الطرق القائمة على الفلورسنت مثل Qubit وPicoGreen التمييز بين هياكل dsDNA غير المكتملة (الإدخالات بدون محول أو مع ربط أحد الطرفين فقط بالمحول) من المكتبات الكاملة. ستعمل طريقة qPCR فقط على تضخيم وقياس المكتبات الكاملة مع ربط كلا الطرفين بالمحولات (المكتبات القابلة للتسلسل)، وبالتالي توفير قياس أكثر دقة للتحميل.
5. يمكن تحليل توزيع حجم المكتبات باستخدام جهاز Agilent Bioanalyzer أو أجهزة أخرى تعتمد على مبادئ الرحلان الكهربائي الشعري أو الميكروفلويديك.
7. مواد أخرى
1. خرزات مغناطيسية لتنقية الحمض النووي: Hieff NGSالعلامة التجارية خرز اختيار الحمض النووي (Yeasen Cat#12601) أو AMPure® خرز XP (A63880) أو منتجات أخرى معادلة.
2.المحولات: محول كامل لـ Illumina: Yeasen Cat#13519-13520; 384 Dual CDI Primers: Yeasen القطة رقم 12412~القط رقم 12413؛ 384 تمهيدات فريدة ذات مؤشر مزدوج (UDI): ياسين القطة رقم 12312~القط رقم 12315؛ محولات UMI UDI: Yeasen Cat#13370~Cat#13371; محول كامل لـ MGI: Yeasen Cat#13360-13362. مزيج تمهيدي للحمض النووي:القطة رقم 12190 أو القطة رقم 12191.
3. تحليل جودة المكتبة: شريحة Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000/ شريحة عالية الحساسية أو منتجات أخرى مكافئة؛ الكواشف الكمية للمكتبة.
4. مواد أخرى: الإيثانول المطلق، الماء النقي للغاية المعقم، أطراف الماصة ذات الاحتفاظ المنخفض، أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل، الحوامل المغناطيسية، الدورة الحرارية، إلخ.
8. سير العمل
الشكل 1. سير العمل وان بوت محترف الحمض النووي مجموعة أدوات التحضير للمكتبة
الأرقام
أحجام شظايا الإدخال التي تم الحصول عليها في ظل ظروف تفتيت مختلفة
باستخدام 500 نانوجرام من gDNA القياسي كقالب، تم إنشاء المكتبات باستخدام هذه المجموعة. كانت ظروف التفتت عبارة عن هضم إنزيمي عند 32 درجة مئوية و35 درجة مئوية و37 درجة مئوية لمدة 5 و10 و15 و20 و30 دقيقة على التوالي. تم تنقية المنتجات المجزأة باستخدام 1.2x خرز مغناطيسي وتم غسلها بـ 21 ميكرولتر من ddH2تم قياس التركيز باستخدام جهاز Qubit، ويظهر توزيع شظايا الإدخال المستردة في الشكل التالي.
 |
الشكل 2. ملفات تعريف المكتبة عند 32 درجة مئوية لأوقات هضم إنزيمية مختلفة
 |
 |
الدفع والأمن
تتم معالجة معلومات الدفع الخاصة بك بشكل آمن. لا نقوم بتخزين تفاصيل بطاقة الائتمان ولا يمكننا الوصول إلى معلومات بطاقة الائتمان الخاصة بك.
سؤال
قد تعجبك أيضًا
التعليمات
المنتج مخصص لأغراض البحث فقط وليس مخصصًا للاستخدام العلاجي أو التشخيصي لدى البشر أو الحيوانات. المنتجات والمحتوى محميان بموجب براءات الاختراع والعلامات التجارية وحقوق الطبع والنشر المملوكة لشركة Yeasen Biotechnology. تشير رموز العلامة التجارية إلى بلد المنشأ، وليس بالضرورة التسجيل في جميع المناطق.
قد تتطلب بعض التطبيقات حقوق الملكية الفكرية الإضافية لجهات خارجية.
تلتزم شركة Yeasen بالعلوم الأخلاقية، حيث تؤمن بأن أبحاثنا يجب أن تعالج الأسئلة الحرجة مع ضمان معايير السلامة والأخلاق.