تستخدم مجموعة الكشف عن موت الخلايا المبرمج Annexin V-EGFP/PI Annexin V المسمى بـ EGFP كمسبار للكشف عن حدوث موت الخلايا المبرمج المبكر.
مبدأ الكشف هو كما يلي: في الخلايا الحية الطبيعية، يقع فوسفوتيديل سيرين (PS) على الجانب الداخلي من غشاء الخلية، ولكن في الخلايا الميتة المبكرة، ينقلب PS من الجانب الداخلي لغشاء الخلية إلى سطح غشاء الخلية ويتعرض للبيئة خارج الخلية. Annexin-V هو Ca²⁺ بروتين مرتبط بالفوسفوليبيد يعتمد على الفوسفوليبيد وله وزن جزيئي يتراوح بين 35 إلى 36 كيلو دالتون ويرتبط بـ PS بألفة عالية. يمكن أن يرتبط فوسفاتيديل سيرين بغشاء الخلايا الميتة المبكرة من خلال فوسفاتيديل سيرين المكشوف على السطح الخارجي للخلية.
بالإضافة إلى ذلك، يتم توفير يوديد البروبيديوم (PI) للتمييز بين الخلايا المبكرة الباقية والخلايا الميتة أو المتأخرة في موت الخلية. PI عبارة عن صبغة حمض نووي، لا يمكنها المرور عبر الغشاء الخلوي السليم للخلايا الطبيعية أو الخلايا الميتة المبكرة في موت الخلية ولكنها يمكن أن تمر عبر الغشاء الخلوي للخلايا الميتة المتأخرة والميتة وتجعل النواة حمراء. وبالتالي، عندما تم دمج Annexin V مع PI، تم استبعاد PI من الخلايا الحية (Annexin V^-/باي^-) والخلايا الميتة المبكرة (Annexin V⁺/باي^-). كانت الخلايا الميتة المتأخرة والمتنخرة إيجابية بشكل مزدوج لكل من EGFP وPI (Annexin V⁺/باي⁺).
هذه المجموعة مناسبة لقياس التدفق الخلوي والمجهر الفلوري.

مكونات المنتج

الشحن والتخزين

يتم شحن المكونات مع كيس ثلج ويمكن تخزينها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية بعيدًا عن الضوء، وتجنب التجميد والذوبان المتكرر لمدة عام واحد.
[ملاحظات]: إذا كان من الضروري استخدامه بشكل متكرر في فترة قصيرة، فيمكن تخزينه عند 4 درجات مئوية وحمايته من الضوء لمدة نصف عام.

تحذيرات

1) بما أن عملية موت الخلايا المبرمج سريعة، فمن المستحسن تحليل العينات خلال ساعة واحدة بعد التلوين.
2) بالنسبة للخلايا الملتصقة، فإن الهضم هو خطوة بالغة الأهمية. لا تستخدم EDTA في المحلول الهضمي لأن EDTA يمكن أن يؤثر على ارتباط Annexin V بـ PS.
3) يجب استخدام Annexin V-FITC، وليس Annexin V-EGFP، لتثبيت الخلايا، مثل الكشف عن موت الخلايا المبرمج والدورة الخلوية في نفس الوقت، لأن EGFP سوف يتحلل ويفقد قدرته على إثارة الفلورسنت أثناء التثبيت. تم حضانة الخلايا مع Annexin V-FITC قبل التثبيت وتم غسل Annexin V-FITC غير المرتبط باستخدام Binding Buffer.لأن زيادة نفاذية الخلايا أثناء التثبيت تخلق حطامًا خلويًا يمكن أن يرتبط بـ Annexin V ويتداخل مع النتائج.
4) إذا كانت العينة من الدم، تأكد من إزالة الصفائح الدموية من الدم. لأن الصفائح الدموية تحتوي على PS، والتي يمكن أن ترتبط بـ Annexin V، مما يتداخل مع النتائج. يمكن غسل الصفائح الدموية باستخدام عامل تخزين يحتوي على EDTA والطرد المركزي بسرعة 200 جم.
5) يرجى طرد الكاشف لفترة وجيزة قبل فتح الغطاء، ورمي السائل على الجدار الداخلي للغطاء إلى أسفل الأنبوب لتجنب تناثر السائل عند فتح الغطاء.
6) Annexin V-EGFP وPI عبارة عن مواد حساسة للضوء، لذا يرجى تجنب الضوء أثناء التشغيل.
7) للاستخدام البحثي فقط!

تعليمات

تصميم التجربة
أنبوب فارغ: تم استخدام خلايا التحكم السلبية بدون Annexin V-EGFP ومحلول التلوين PI لتنظيم الجهد.
أنابيب ملطخة بشكل فردي: تم استخدام خلايا التحكم الإيجابية، والمكملة فقط بـ Annexin V-EGFP، لتعديل التعويض.
أنبوب الكشف: تمت معالجة الخلايا باستخدام Annexin V-EGFP ومحلول الصبغة PI. تم الحصول على البيانات التجريبية عن طريق تعديل معلمات الأنبوب الفارغ وأنبوب الصبغة المفردة.
1.1 صباغة العينة
1) خلية التعليق: تم جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة 300 جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
الخلايا الملتصقة: بعد الهضم باستخدام التربسين بدون EDTA، تم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة 300 جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. لا ينبغي أن يكون وقت هضم التربسين طويلاً جدًا لمنع النتائج الإيجابية الكاذبة.
2) غسلت الخلايا بمحلول PBS المبرد مسبقًا مرتين، في كل مرة عند 300 جم، وتم طردها عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
3) تم إعادة تعليق الخلايا باستخدام 1×Binding Buffer وتم تعديل التركيز إلى 1~5 ×106/mL.
4) تم إضافة 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي سعة 5 مل، وتمت إضافة 5 ميكرولتر من Annexin V-EGFP، وتم خلط الخلايا وحضنها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة تحت الضوء.
5) بإضافة 10 ميكرولتر من محلول PI و 400 ميكرولتر من PBS، تم إجراء التلوين على الفور.
[ملاحظات]: عند استخدام قياس التدفق الخلوي للكشف عن موت الخلايا المبرمج، يتأثر PI بشكل كبير بالوقت، وسيؤدي الوقت الطويل جدًا إلى زيادة تلطيخ PI، لذلك يجب إكمال قياس التدفق الخلوي في غضون ساعة واحدة.
1.2 تحليل التدفق الخلوي
كان أقصى طول موجة إثارة لـ EGFP هو 488 نانومتر، وكان أقصى طول موجة انبعاث هو 507 نانومتر؛ كان أقصى طول موجة إثارة لمجمع PI-DNA هو 535 نانومتر، وكان أقصى طول موجة انبعاث هو 615 نانومتر. تم استخدام برامج مثل CellQuest للتحليل وتم رسم مخطط نقطي ثنائي اللون، EGFP هو المحور السيني وPI هو الإحداثي. اجمع 10000 حدث لكل عينة. في تجربة نموذجية، يمكن تقسيم الخلايا إلى ثلاث مجموعات فرعية، الخلايا الحية لها فقط فلورسنت خلفي منخفض الكثافة للغاية، والخلايا الميتة المبكرة لها فلورسنت أخضر قوي فقط، والخلايا الميتة المتأخرة لها صبغة مزدوجة فلورية خضراء وحمراء.