مبدأ الكشف عن موت الخلايا المبرمج Annexin V-Alexa Fluor488/PI هو كما يلي: في الخلايا الحية الطبيعية، يقع فوسفوتيديل سيرين (PS) في الجانب الداخلي من غشاء الخلية، ولكن في الخلايا التي تموت فيها الخلايا المبرمجة للموت في وقت مبكر، ينقلب PS من الجانب الداخلي لغشاء الخلية إلى سطح غشاء الخلية ويتعرض للبيئة خارج الخلية. Annexin-V هو Ca²⁺ بروتين مرتبط بالفوسفوليبيد يعتمد على الفوسفوليبيد وله وزن جزيئي يتراوح من 35 إلى 36 كيلو دالتون، ويرتبط بألفة عالية مع PS ويرتبط بالغشاء الخلوي للخلايا الميتة المبكرة من خلال الفوسفاتيديل سيرين المكشوف على السطح الخارجي للخلية.
بالإضافة إلى ذلك، يتم توفير يوديد البروبيديوم (PI) للتمييز بين الخلايا المبكرة الباقية والخلايا الميتة أو المتأخرة في موت الخلية. PI عبارة عن صبغة حمض نووي، لا يمكنها المرور عبر الغشاء الخلوي السليم للخلايا الطبيعية أو الخلايا الميتة المبكرة في موت الخلية ولكنها يمكن أن تمر عبر الغشاء الخلوي للخلايا الميتة المتأخرة والميتة وتجعل النواة حمراء. وبالتالي، عندما تم دمج Annexin V مع PI، تم استبعاد PI من الخلايا الحية (Annexin V^-/باي^-) والخلايا الميتة المبكرة (Annexin V⁺/باي^-). على النقيض من ذلك، كانت الخلايا الميتة المتأخرة والخلايا الميتة إيجابية بشكل مزدوج لـ Alexa Fluor488 وPI (Annexin V⁺/باي⁺).

مكونات المنتج

الشحن والتخزين

يتم شحن المكونات مع كيس ثلج ويمكن تخزينها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة عام واحد.

تحذيرات

1) بما أن عملية موت الخلايا المبرمج سريعة، فمن المستحسن تحليل العينات خلال ساعة واحدة بعد التلوين.
2) بالنسبة للخلايا الملتصقة، فإن الهضم هو خطوة بالغة الأهمية. لا تستخدم EDTA في المحلول الهضمي لأن EDTA يمكن أن يؤثر على ارتباط Annexin V بـ PS.
3) إذا كانت العينة من الدم، تأكد من إزالة الصفائح الدموية من الدم. لأن الصفائح الدموية تحتوي على PS، والتي يمكن أن ترتبط بـ Annexin V، مما يتداخل مع النتائج. يمكن استخدام عامل تخزين يحتوي على EDTA وغسل الصفائح الدموية عن طريق الطرد المركزي بسرعة 200 جم.
4) يرجى طرد الكاشف لفترة وجيزة قبل فتح الغطاء، ورمي السائل على الجدار الداخلي للغطاء إلى أسفل الأنبوب لتجنب تناثر السائل عند فتح الغطاء.
5) Annexin V-Alexa Fluor488 وPI عبارة عن مواد حساسة للضوء ويجب إبعادها عن الضوء عند التعامل معها.
6) للاستخدام البحثي فقط!

تعليمات

1.1 عينة صباغة
1.أ) خلية التعليق: تم جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة 300 جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
ب) الخلايا الملتصقة: بعد الهضم باستخدام التربسين بدون EDTA، تم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة 300 جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. لا ينبغي أن يكون وقت هضم التربسين طويلاً جدًا لمنع النتائج الإيجابية الكاذبة.
2. تم غسل الخلايا مرتين باستخدام PBS المبرد مسبقًا عند 4 درجات مئوية، في كل مرة باستخدام 300 جرام، وتم طردها مركزيًا عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
3. تم إعادة تعليق الخلايا عن طريق إضافة 250 ميكرولتر من 1×Binding Buffer، وتم ضبط التركيز إلى 1×106/مل.
4. تم إضافة 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي سعة 5 مل، وتمت إضافة 5 ميكرولتر من Annexin V-Alexa Fluor 488 و10 ميكرولتر من PI، وتم الخلط بلطف.
5. تم إبعاد التفاعل عن الضوء وحفظه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
6. تمت إضافة 400 ميكرولتر من 1×Binding Buffer، وخلطها، وتم الكشف عن العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي في غضون ساعة واحدة.
[ملاحظات]: لتجنب فقدان الخلايا أثناء غسل الخلايا، يمكن استخدام طرف صغير لشفط السوائل.
1.2 تحليل التدفق الخلوي
يبلغ أقصى طول موجي للإثارة لـ Alexa Fluor488 488 نانومتر وأقصى طول موجي للانبعاث 519 نانومتر؛ وكان أقصى طول موجي للإثارة لمجمع PI-DNA 535 نانومتر، وكان أقصى طول موجي للانبعاث 615 نانومتر. تم استخدام CellQuest وبرامج أخرى لتحليل ورسم مخطط نقطي ثنائي اللون مع Alexa Fluor488 كإحداثي محوري وPI كإحداثي. اجمع 10000 حدث لكل عينة.
1.3 تحليل المجهر الفلوري
1) قم بإسقاط قطرة من تعليق الخلايا الملطخ مرتين بـ Annexin V-FITC/PI على الشريحة وقم بتغطية الخلايا بغطاء منزلق.
2) تم رصده تحت المجهر الفلوري باستخدام مرشح ثنائي اللون. كانت إشارة فلورسنت Annexin V-FITC باللون الأخضر، وكانت إشارة فلورسنت PI باللون الأحمر.