عندما تخضع الخلايا لعملية موت الخلايا المبرمج، فإنها تقوم بتنشيط إنزيمات نوكليازية تقطع الحمض النووي الجيني بين النيوكليوسومات. بعد استخلاص الحمض النووي أثناء عملية موت الخلايا المبرمج، يمكن العثور على سلم الحمض النووي بطول 180-200 زوج قاعدي.
يمكن استخدام مجموعة الكشف عن موت الخلايا المبرمج TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling) (Alexa Fluor 640) للكشف عن تفتت الحمض النووي في عملية موت الخلايا المبرمج المتأخرة للخلايا النسيجية. والمبدأ هو أنه تحت تأثير Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT)، يتم دمج Alexa Fluor 640-12-DUTP في 3´ -hydroxyl (3´-OH) Terminal المكشوف أثناء كسر الحمض النووي الجينومي. وبالتالي، يمكن اكتشافه بواسطة المجهر الفلوري أو قياس التدفق الخلوي. Alexa Fluor 640 عبارة عن صبغة فلورية حمراء ذات ثبات عالي وسطوع قوي.
تتمتع هذه المجموعة بمجموعة واسعة من التطبيقات ويمكن استخدامها للكشف عن موت الخلايا المبرمج في الأقسام المجمدة أو المصنوعة من البارافين، وكذلك في الخلايا الملتصقة أو المعلقة المزروعة.

مكونات المنتج

الشحن والتخزين

يتم شحن المكونات مع كيس ثلج ويمكن تخزينها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة عام واحد.

تحذيرات

1. من الضروري تحضير محلول PBS الخاص بك لغسل الخلايا، ومحلول إخماد الفلورسنت لإغلاق الأقراص، و4% بارافورمالدهيد للتثبيت. قد تحتاج الكريات البيضاء إلى الزراعة لفترة طويلة.
2. للاستخدام البحثي فقط!

تعليمات

1. إعداد العينة
1.1 أقسام الأنسجة المضمنة بالبارافين
1.1.1. تم غمر أقسام أنسجة البارافين في الزيلين لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتكررت مرة واحدة لإزالة البارافين تمامًا.
1.1.2.انقعي الأقسام في الإيثانول بنسبة 100% لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وكرري ذلك مرة واحدة.
1.1.3.عند درجة حرارة الغرفة، تم نقع العينات في الإيثانول المتدرج (90، 80، 70٪) لمدة 3 دقائق في كل مرة.
1.1.4. اشطف الأقسام برفق باستخدام PBS وامسح بعناية السائل الزائد حول العينة على الشرائح الزجاجية باستخدام ورق الترشيح. في هذه الحالة، يمكن استخدام قلم البارافين أو القلم الكاره للماء لرسم الخطوط العريضة لتوزيع العينة حول العينة، وهو أمر مناسب لمعالجة النفاذية اللاحقة وعملية وضع العلامات على التوازن. لا تترك العينة تجف أثناء التجربة. ضع العينة المعالجة في الصندوق المبلل للحفاظ على العينة مبللة.
1.1.5.2 ملغ/مل تم تخفيف محلول بروتيناز ك باستخدام PBS بنسبة 1:100 للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 20 ميكروغرام/مل.
1.1.6.100 ميكرولتر من محلول بروتيناز ك بتركيز 20 ميكروجرام/مل تم إضافته إلى كل عينة لتغطيتها بالكامل وحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
[ملاحظات]: يساعد بروتيناز ك الأنسجة والخلايا على أن تصبح نافذة للمواد الملطخة في الخطوات اللاحقة. إن طول فترة الحضانة يزيد من خطر سقوط أقسام الأنسجة من صفيحة الناقل في خطوات الغسيل اللاحقة، في حين أن قصر فترة الحضانة قد يؤدي إلى معالجة غير كافية للنفاذية ويؤثر على كفاءة الوسم. للحصول على نتائج أفضل، قد يكون من الضروري تحسين فترة الحضانة لبروتيناز ك.
1.1.7. اشطف العينة مرتين إلى ثلاث مرات بمحلول PBS، ثم قم بإزالة السائل الزائد برفق، ثم امسح السائل بعناية حول العينة على الشريحة باستخدام ورق الترشيح. توضع العينة المعالجة في صندوق مبلل للحفاظ على رطوبة العينة.
1.2 قسم مجمد من الأنسجة
1.2.1. قم بإزالة الأجزاء المجمدة وأعدها إلى درجة حرارة الغرفة. تم غمر الشرائح في محلول بارافورمالدهيد 4% (مذاب في PBS) وتم تثبيتها وحضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
1.2.2. قم بإزالة السائل الزائد بلطف واستخدم ورق الترشيح لتجفيف السائل الزائد حول العينة على الشريحة الزجاجية بعناية.
1.2.3. تم غمر الشرائح في محلول PBS، وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، ثم غسلت بمحلول PBS مرة أخرى مرتين في المجموع.
1.2.4. قم بإزالة السائل الزائد برفق ثم امسح الشريحة الزجاجية بعناية باستخدام ورق الترشيح لإزالة السائل الزائد حول العينة. في هذه الحالة، يمكن استخدام قلم البارافين أو القلم الكاره للماء لرسم الخطوط العريضة لتوزيع العينة حول العينة، وهو أمر مناسب لمعالجة النفاذية اللاحقة وعملية وضع العلامات على التوازن. أثناء التجربة، لا تترك العينة تجف، ضع العينة المعالجة في الصندوق المبلل للحفاظ على العينة مبللة.
1.2.5. تم تخفيف محلول 2 ملغ/مل من بروتيناز ك باستخدام PBS بنسبة 1:100 للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 20 ميكروغرام/مل.
1.2.6. تمت إضافة 100 ميكرولتر من محلول بروتيناز ك بتركيز 20 ميكروجرام/مل إلى كل عينة لتغطيتها بالكامل وحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
[ملاحظات]: يساعد بروتيناز ك الأنسجة والخلايا على أن تكون نفاذة لمواد التلوين في الخطوات اللاحقة. سيؤدي وقت الحضانة الطويل جدًا إلى زيادة خطر سقوط أقسام الأنسجة من لوحة الناقل في خطوات الغسيل اللاحقة، في حين أن وقت الحضانة القصير جدًا قد يتسبب في معالجة نفاذية غير كافية ويؤثر على كفاءة الوسم. قد يكون من الضروري تحسين وقت حضانة بروتيناز ك إذا لم يتم الحصول على نتائج أفضل.
1.2.7. اشطف العينة مرتين إلى ثلاث مرات في كوب مفتوح يحتوي على محلول PBS.
[ملاحظات]: لتجنب فقدان تقشير العينة في خطوة التنظيف، يوصى بعدم غسل الزجاجة، ولكن نقع الشرائح الزجاجية في محلول PBS 2-3 مرات للتنظيف.
1.2.8. قم بإزالة السائل الزائد بلطف واستخدم ورق الترشيح لتجفيف السائل بعناية حول العينة الموجودة على الشريحة.يتم وضع العينة المعالجة في صندوق مبلل للحفاظ على رطوبة العينة.
1.3 تحضير ورقة الزحف الخلوي
تمت تربية الخلايا الملتصقة على شرائح غرفة Lab-Tek. بعد العلاج بتحريض موت الخلايا المبرمج، تم غسل الشرائح مرتين باستخدام PBS.
1.4 تحضير مسحات الخلايا (مع أخذ الشرائح المغطاة بالبولي ليسين كمثال)
1.4.1. تم إعادة تعليق الخلايا في PBS بتركيز حوالي 2×107 خلية / مل، وتم شفط 50-100 ميكرولتر من تعليق الخلايا على شرائح مغلفة بالبولي ليسين، وتم نشر تعليق الخلايا برفق باستخدام شريحة نظيفة.
1.4.2. تم تثبيت الخلايا، وتم غمر الشرائح في خزان صبغ يحتوي على 4% من البارافورمالدهيد المحضر حديثًا في PBS ووضعها عند 4 درجات مئوية لمدة 25 دقيقة.
1.4.3. تم غسل الشرائح وغمرها في PBS وتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ثم غسلها مرة أخرى بـ PBS.
1.4.4. قم بإزالة السائل الزائد برفق ثم امسح الشريحة الزجاجية بعناية باستخدام ورق الترشيح لإزالة السائل الزائد حول العينة. في هذه الحالة، يمكن استخدام قلم البارافين أو القلم الكاره للماء لتحديد توزيع العينة حول العينة لتسهيل معالجة النفاذية اللاحقة وعمليات وضع العلامات المتوازنة. أثناء التجربة، لا تترك العينة تجف، ضع العينة المعالجة في الصندوق المبلل للحفاظ على العينة مبللة.
1.4.5. تم تخفيف محلول 2 ملغ/مل من بروتيناز ك باستخدام PBS بنسبة 1:100 للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 20 ميكروغرام/مل.
1.4.6. تمت إضافة 100 ميكرولتر من محلول بروتيناز ك بتركيز 20 ميكروجرام/مل إلى كل عينة لجعلها مغطاة بالكامل وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق (يمكن أيضًا غمرها في محلول Triton X-100 بنسبة 0.2% المحضر في PBS وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لعلاج النفاذية).
[ملاحظات]: يساعد بروتيناز ك الأنسجة والخلايا على أن تكون نفاذة لمواد التلوين في الخطوات اللاحقة. سيؤدي وقت الحضانة الطويل جدًا إلى زيادة خطر سقوط أقسام الأنسجة من لوحة الناقل في خطوات الغسيل اللاحقة، في حين أن وقت الحضانة القصير جدًا قد يتسبب في معالجة نفاذية غير كافية ويؤثر على كفاءة الوسم. قد يكون من الضروري تحسين وقت حضانة بروتيناز ك إذا لم يتم الحصول على نتائج أفضل.
1.4.7. اشطف العينة مرتين إلى ثلاث مرات باستخدام PBS، ثم قم بإزالة السائل الزائد برفق، ثم امسح السائل بعناية حول العينة على الشريحة باستخدام ورق الترشيح. ثم وضعت العينات المعالجة في صندوق مبلل.
2. خطوات معالجة DNase للضوابط الإيجابية
بعد نفاذية العينة، تم معالجة الخلايا باستخدام DNase I لإعداد شرائح التحكم الإيجابية. عادة ما تتسبب هذه العملية في إصابة معظم الخلايا تمت معالجتها لإظهار الفلورسنت الأخضر.
[ملاحظات]: يؤدي علاج الخلايا المثبتة بـ DNase I إلى كسر الحمض النووي الكروموسومي، مما يؤدي إلى إنتاج العديد من نهايات 3 ' من الحمض النووي التي يمكن تمييزها.
2.1. قم بتخفيف محلول 10×DNase I Buffer بالماء منزوع الأيونات بنسبة 1:10 (يُطلب 200 ميكرولتر من محلول 1×DNase I Buffer لكل عينة، أي أن 20 ميكرولتر من محلول 10×DNase I Buffer و180 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات مطلوبان للتخفيف). تمت إضافة قطرة 100 ميكرولتر إلى العينة النفاذة وحضنت لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أضف 1 ميكرولتر من محلول 1×DNase I Buffer (1U/μL) إلى 100 ميكرولتر المتبقية من محلول 1×DNase I Buffer لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 10 وحدات/مل.
2.2. تم سحب السائل برفق، ثم تمت إضافة 100 ميكرولتر من المحلول العازل المحتوي على 10 وحدة/مل من DNase I وتم حضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
2.3. انقر على الشريحة لإزالة السائل الزائد، ثم اغسل الشريحة جيدًا 3-4 مرات في خزان الصبغة بالماء منزوع الأيونات.
[ملاحظات]: يجب استخدام خزان تلوين منفصل لشرائح التحكم الإيجابية، وإلا فإن بقايا DNase I على شرائح التحكم الإيجابية قد تؤدي إلى ظهور خلفية عالية على الشرائح التجريبية.
3. وضع العلامات والكشف
3.1.يتم تخفيف محلول التوازن (5 × محلول التوازن) بالماء منزوع الأيونات بنسبة 1:5 (يلزم 100 ميكرولتر من محلول التوازن لكل عينة).
3.2. تمت إضافة عازل التوازن (100 ميكرولتر × 1 عازل توازن) إلى كل عينة لموازنة المنطقة تمامًا وحضنت لمدة 10-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بدلاً من ذلك، قم بالانزلاق في وعاء به 1 × عازل توازن للتأكد من أن الشرائح لا توازن العينة. قم بإذابة مزيج وسم Alexa Fluor 640-12-dUTP على الثلج أثناء موازنة الخلايا، وقم بإعداد كمية كافية من عازل حضانة TdT لجميع التجارب وتفاعلات التحكم الإيجابية الاختيارية وفقًا للجدول 1. بالنسبة للتفاعل القياسي بمساحة أقل من 5 سم2، يكون الحجم 50 ميكرولترًا، ويتم ضرب 50 ميكرولترًا في عدد تفاعلات التحكم التجريبية والإيجابية لتحديد الحجم الإجمالي لمحلول حضانة TdT المطلوب. بالنسبة للعينات ذات المساحات السطحية الأكبر، يمكن زيادة حجم الكاشف بشكل متناسب.

الجدول 1. مخازن حضانة TdT المعدة للتجارب وتفاعلات التحكم الإيجابية الاختيارية

[نظام التحكم السلبي]: تم تحضير محلول حضانة تحكم بدون إنزيم TdT وتم استبدال إنزيم TdT بـ ddH2O.
3.3. تم غسل معظم محلول 100 ميكرولتر من محلول التوازن 1× بورق ماص حول المنطقة المتوازنة ثم تمت إضافة محلول حضانة 50 ميكرولتر من محلول 50 ميكرولتر إلى مساحة 5 سم2 من الخلايا. لا تترك الخلايا تجف. بعد ذلك، يجب حماية الشريحة من الضوء.
3.4. ضع غطاء بلاستيكي فوق الخلايا لضمان توزيع المواد الكيميائية بالتساوي، ثم ضع منشفة ورقية مبللة بالماء في أسفل الصندوق المبلل. ثم وضعت الشرائح في صندوق مبلل وحضنت عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. ثم لف الصندوق المبلل بورق ألومنيوم لحمايته من الضوء.
[ملاحظات]: يمكن قطع غطاء الزجاج البلاستيكي إلى نصفين قبل الاستخدام. قم بطي حافة غطاء الزجاج لسهولة الإزالة والتعامل.
3.5. تم إزالة الأغطية البلاستيكية، وتم حضن المقاطع في محلول PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ثم تم غسل المقاطع مرتين بمحلول PBS جديد.
3.6. امسح محلول PBS بلطف حول وعلى الجزء الخلفي من العينة باستخدام ورق الترشيح.
[ملاحظات]: من أجل تقليل الخلفية، بعد غسل الشرائح باستخدام PBS مرة واحدة، يمكن غسلها باستخدام PBS يحتوي على 0.1% Triton X-100 و5 ملغ/مل BSA 3 مرات، 5 دقائق في كل مرة، بحيث تكون العلامات الحرة غير المتفاعلة واضحة ونظيفة.
3.7. تم صبغ العينات في خزان صبغ، وتم غمر الشرائح في خزان صبغ يحتوي على محلول PI (1 ميكروجرام/مل، محضر حديثًا ومخفف بـ PBS) في الظلام وتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. (اختياري): تم صبغ العينات في خزان صبغ، وتم غمر الشرائح في خزان صبغ يحتوي على محلول DAPI (2 ميكروجرام/مل، محضر حديثًا ومخفف بـ PBS) في الظلام وتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
3.8.اغسل العينة، ثم اغمر الشريحة في الماء منزوع الأيونات واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. كرر ذلك مرتين لإجمالي ثلاث غسلات.
3.9. تم تجفيف الماء الزائد على الشريحة وتم إضافة 100 ميكرولتر من PBS إلى منطقة العينة للحفاظ على رطوبة العينة.
3.10. تم تحليل العينات على الفور تحت المجهر الفلوري، وتم الكشف عن فلورسنت أحمر Alexa Fluor 640 عند 620 نانومتر ولوحظ DAPI الأزرق عند 460 نانومتر. يمكن لـ DAPI أن يصبغ الخلايا الميتة وغير الميتة باللون الأزرق، وفي النوى الميتة فقط تم دمج Alexa Fluor 640-12-dUTP وفلورسنت أحمر موضعي. إذا لزم الأمر، يمكن تخزين الشرائح طوال الليل عند 4 درجات مئوية في الظلام.
4. تم الكشف عن الخلايا المعلقة بواسطة قياس التدفق الخلوي
4.1. تم غسل 3~5×106 خلية مرتين باستخدام PBS عن طريق الطرد المركزي (300×g) عند 4 درجات مئوية، وتم الطرد المركزي بسرعة 300 جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق، ثم إعادة تعليقها في 0.5 مل من PBS.
4.2. تم تثبيت الخلايا، وتم إضافة 5 مل من محلول بارافورمالدهيد 1% المحضر في PBS ووضعه على الثلج لمدة 20 دقيقة.
4.3. تم طرد الخلايا بسرعة 300 × ز عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق، وتم إزالة السائل العلوي وإعادة تعليقه في 5 مل من PBS. تم تكرار الغسيل مرة واحدة وتم إعادة تعليق الخلايا مع 0.5 مل من PBS.
4.4. تم نفاذ الخلايا، وأضيف 5 مل من الإيثانول بنسبة 70% المبرد مسبقًا بالثلج وحضنت عند -20 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. يمكن تخزين الخلايا في الإيثانول بنسبة 70% عند -20 درجة مئوية لمدة أسبوع، أو يمكن جعل الخلايا منفذة بمحلول Triton X-100 بنسبة 0.2% المحضر في PBS وتخزينه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
4.5. تم طرد الخلايا بسرعة 300 × ز لمدة 10 دقائق ثم أعيد تعليقها في 5 مل من محلول فوسفات الصوديوم. ثم تكررت عملية الطرد المركزي وأعيد تعليقها في 1 مل من محلول فوسفات الصوديوم.
4.6. نقل 2 × 106 خلية إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير سعة 1.5 مل.
4.7. تم طرد التوازن بالطرد المركزي عند 300 × ز لمدة 10 دقائق، وتم إزالة السائل العلوي وإعادة تعليقه مع 80 ميكرولترًا من 1 × عازل التوازن. تم الحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
4.8. أثناء موازنة الخلايا، تم إذابة خليط وسم Alexa Fluor 640-12-dUTP على الجليد، وتم تحضير كمية كافية من محلول حضانة TdT لجميع التفاعلات وفقًا للجدول 1. بالنسبة لتفاعل قياسي مكون من 2 × 106 خلية، كان الحجم 50 ميكرولترًا، وتم ضرب 50 ميكرولترًا في عدد التفاعلات لتحديد الحجم الإجمالي لمحلول حضانة TdT المطلوب.
4.9. تم طرد الخلايا بسرعة 300 × ز لمدة 10 دقائق، وتم إزالة السائل العلوي وإعادة تعليق الراسب في 50 ميكرولتر من محلول حضانة TdT وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، محمية من الضوء. تم إعادة تعليق الخلايا برفق كل 15 دقيقة باستخدام ماصة دقيقة.
4.10. تم إنهاء التفاعل بإضافة 1 مل من 20 مليمولار EDTA وخلطه بلطف باستخدام ماصة صغيرة.
4.11. بعد الطرد المركزي بسرعة 300 جرام لمدة 10 دقائق، تم التخلص من السائل العلوي وتم إعادة تعليق الراسب في 1 مل من محلول Triton X-100 بنسبة 0.1% المحضر في PBS، والذي يحتوي على 5 مجم/مل من BSA. تم تكرار المحلول مرة واحدة وغسله مرتين في المجموع.
4.12. تم تحليل الخلايا باستخدام مقياس التدفق الخلوي وتم قياس الفلورسنت الأحمر Alexa Fluor 640 عند 620 نانومتر.