فيرو تُستخدم مجموعة الكشف عن بقايا الحمض النووي للخلية المضيفة للتحليل الكمي لمخلفات الحمض النووي للخلية المضيفة في العينات الوسيطة والمنتجات شبه المصنعة والنهائية لمختلف المنتجات البيولوجية.

تعتمد هذه المجموعة على مسبار فلورسنت Taqman وطريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، والتي تتمتع بحد أدنى للكشف عن مستوى fg ويمكنها الكشف بشكل محدد وسريع عن الحمض النووي المتبقي لخلايا Vero. يجب استخدام المجموعة مع مجموعة تحضير عينة الحمض النووي المتبقي (رقم الكتالوج 18461ES).

منتج عناصر

^*IC: الرقابة الداخلية

الشحن والتخزين

1. يتم شحنها على الجليد الجاف ويتم تخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية ل2 سنة

2. بعد استلام البضائع، يرجى التحقق منها وتخزينها في درجة حرارة التخزين المناسبة على الفور.

تحذيرات

1. يرجى قراءة هذا الدليل بعناية قبل استخدام هذا الكاشف، ويجب توحيد التجربة، بما في ذلك التعامل مع العينة، وإعداد نظام التفاعل وإضافة العينة.

2. من الأفضل أن تتم إضافة العينات وتحضير الحلول على الجليد.

3. تأكد من أن كل مكون تم مزجه بالكامل وطرده بسرعة منخفضة قبل الاستخدام.

4. من أجل سلامتك وصحتك، يرجى ارتداء المعاطف المخبرية والقفازات التي تستخدم لمرة واحدة أثناء العمل.

5. هذا المنتج مخصص للاستخدام البحثي فقط!

نماذج الأجهزة القابلة للتطبيق

تشمل ولكن لا تقتصر على:

بيو-راد: وحدة بصرية CFX96.

ثيرمو ساينتيفيك: أيه بي آي 7500؛ ABI Quant Studio 5؛ خطوة ABI OnePlus.

استخدام التعليمات

1. فيرو تخفيف معيار DNA وتحضير المنحنى القياسي

الفيرو تم تخفيف DNA Control تدريجيًا باستخدام DNA Dilution Buffer الموجود في المجموعة، وتركيز التخفيف هو 300 بيكو جرام/ميكرولتر، 30 بيكو جرام/ميكرولتر، 3 بيكو جرام/ميكرولتر، 300 بيكو جرام/ميكرولتر، 30 بيكو جرام/ميكرولتر، 3 fg/ميكرولتر.

انظر التعليمات التفصيلية أدناه:

1.1 إذابة الثلج فيرو التحكم في الحمض النووي وتخفيف الحمض النووي على الجليد. بعد إذابته تمامًا، قم بالخلط بلطف، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة منخفضة لمدة 10 ثوانٍ.

1.2 أخرج ستة أنابيب نظيفة بحجم 1.5 مل، ومُشار إليها بـ 3 نانوجرام/ميكرولتر، ①، ②، ③، ④، ⑤، ⑥.

1.3 أضف 90 ميكرولترًا من محلول تخفيف الحمض النووي و10 ميكرولترًا من محلول فيرو التحكم في الحمض النووي الى 1.أنبوب ميكروفيج سعة 5 مل يحمل علامة 3 نانوجرام/ميكرولتر، ويُخفف إلى 3 نانوجرام/ميكرولتر. امزج ثم ضعه في جهاز الطرد المركزي لمدة 10 ثوانٍ. ضع معيار الحمض النووي المخفف في عبوة فرعية ويمكن تخزينه لفترة قصيرة (لا تزيد عن 3 أشهر) عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. يرجى تجنب التجميد والذوبان المتكرر.

1.4 أضف 90 ميكرولترًا من محلول تخفيف الحمض النووي إلى محلول آخر الأنابيب، ثم اتبع الإجراء أدناه للتخفيفات التسلسلية.

[ملحوظات]:

1. يلزم وجود ثلاثة آبار مكررة لكل تركيز. نطاق الكشف هو 3 fg/μL-300pg/μL و يمكن توسيع هذا النطاق إذا لزم الأمر.

2. لتقليل عدد مرات التجميد والذوبان المتكررة وتجنب التلوث، يوصى بتخزين عنصر التحكم في الحمض النووي في أجزاء صغيرة عند -80 درجة مئوية لأول مرة.

3. بمجرد إذابته، يمكن لمحلول تخفيف الحمض النووي أن يتم تخزينها في درجة حرارة تتراوح بين 2-8 درجة مئوية لمدة 7 أيام، إذا لم يتم استخدامه لفترة طويلة، يرجى تخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية.

4. تأكد من خلط القالب بالكامل، ثم رج الخليط برفق لمدة تتراوح بين 15 ثانية إلى دقيقة واحدة لكل تخفيف التدرج.

2. إعداد التحكم في الاستخراج والاسترداد (ERC)

ضبط التركيز من فيرو الحمض النووي في ERC حسب الحاجة (عينة ERC تم تحضيره باستخدام 3 بيكو جرام/ميكرولتر من الحمض النووي كمثال، على النحو التالي:

2.1 أضف 100 ميكرولتر من عينة الاختبار إلى أنبوب نظيف سعة 1.5 مل، ثم أضف 10 ميكرولتر من 3 بيكو جرام/ميكرولتر من فيرو معيار الحمض النووي (③) واخلطه جيدًا، ووضع علامة عليه بـ ERC.

2.2 قم بإجراء استخراج الحمض النووي من عينة ERC مع عينات الاختبار لإعداد ERC المنقى عينة.

3. إعداد عينة التحكم الإيجابية (PCS) (اختياري)

ضبط التركيز من فيرو الحمض النووي في PCS حسب الحاجة (PCS) تم تحضيره باستخدام 3 بيكو جرام/ميكرولتر من الحمض النووي كمثال، على النحو التالي:

3.1 أضف 100 ميكرولتر 3 بيكو جرام/ميكرولتر من فيرو معيار الحمض النووي (③) في أنبوب نظيف سعة 1.5 مل، ثم يتم وضع علامة PCS عليه.

3.2 قم بإجراء استخراج الحمض النووي لـ PCS مع عينات الاختبار لإعداد PCS المنقى.

4. سلبي إعداد محلول التحكم (NCS)

قم بضبط التحكم السلبي في التجربة، وخطوات التشغيل المحددة هي كما يلي:

4.1 أضف 100 ميكرولتر عينة المصفوفة (أو عازل تخفيف الحمض النووي) في أنبوب نظيف سعة 1.5 مل، ثم يتم وضع علامة عليها كـ NCS.

4.2 قم بإجراء استخراج الحمض النووي لعينة NCS مع عينات الاختبار لإعداد عينة NCS النقية.

5. لا يوجد تحضير للتحكم بالقالب (NTC)

تعيين عدم وجود قالب للتحكم في التجربة، تكون خطوات التشغيل المحددة كما يلي:

5.1 لا يتطلب NTC أي معالجة مسبقة للعينة ويمكن تكوينه في مرحلة اكتشاف qPCR لمحتوى الحمض النووي المتبقي.

5.2 عينة NTC في كل أنبوب أو بئر هي 20 ميكرولتر مزيج (أي 16 ميكرولتر مزيج فيرو qPCR + 4 ميكرولتر مزيج من البرايمر والمسبار من فيرو + 20 ميكرولتر مخزن تخفيف الحمض النووي. يوصى بتكوين ثلاث آبار مكررة.

6. نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل

[ملحوظات]:

1. احسب الحجم الإجمالي لتفاعل PCR بعدد التفاعلات: qPCR Mix =(عدد التفاعلات +2) × (16 +4) ميكرولتر (بما في ذلك خسائر بئري التفاعل). يوصى بأكثر من ثلاث تكرارات لكل عينة في التجربة.

2. بعد تغطية الأنبوب أو إحكام غلق اللوحة، قم بطرد أنبوب التفاعل أو اللوحة بسرعة منخفضة لمدة 10 ثوانٍ. بعد رجها وخلطها لمدة 5 ثوانٍ، كرر عملية الطرد المركزي لجمع السائل من الغطاء أو الجدار إلى القاع. تجنب الفقاعات أثناء التشغيل.

انظر الجدول أدناه لإعداد اللوحة الموصى بها:

يتضمن تخطيط اللوحة: 1 NTC (لا نموذج التحكم)، 1 مركز التحكم الوطني (السيطرة السلبية حل)، 6 STD (المنحنى القياسي لـ 6 التركيزات القياسية، 3 TS (عينات الاختبار)، 3 ERC (التحكم في الاستخراج والاسترداد)، 1 قطعة (عينة تحكم إيجابية).ثلاثة آبار مكررة لكل عينة.

7. إرشادات الإعداد لجهاز PCR (طريقة الخطوتين)

تنطبق التعليمات التالية فقط على جهاز Thermo ABI 7500 qPCR (إصدار البرنامج 2.0). إذا كنت تستخدم جهازًا مختلفًا، فراجع دليل الجهاز المعمول به للحصول على إرشادات الإعداد.

7.1 قم بإنشاء تجربة جديدة، واختر قالب القياس المطلق أو القالب المحدد من قبل المستخدم.

7.2 في واجهة "تعريف" وجزء "الأهداف"، أضف هدفًا وسمّه FAM، واختر المُبلغ كـ "FAM" والمُخمِّد كـ "لا شيء".

7.3 في جزء "العينات"، أضف جميع معلومات العينات بالترتيب. ثم حدد الآبار، واختر الهدف والعينات وفقًا لذلك. اضبط مهمة Vero معيار الحمض النووي كمعيار، وتعيين القيم 300000، 30000، 3000، 300، 30، 3 (وحدة تركيز الحمض النووي في كل بئر هي fg/μL) في عمود الكمية، وقم بتسمية الآبار STD 1، STD 2، STD 3، STD 4، STD 5، STD 6، وفقًا لذلك. اضبط مهمة NTC على أنها NTC. اضبط NCS وTS وERC و PCS كـ "غير معروف"، ثم قم بتسميتهم وفقًا لتخطيط اللوحة أعلاه. ثم انقر فوق "التالي".

7.4 اضبط برنامج التضخيم: اضبط حجم التفاعل على 40 ميكرولترًا.

8. تحليل نتائج qPCR

8.1 سيعطي النظام تلقائيًا الحد الأدنى في لوحة مخطط التضخيم في التحليل. في بعض الأحيان، تكون الحد الأدنى الذي يعطيه النظام قريبًا جدًا من خط الأساس، مما يؤدي إلى اختلاف كبير في Ct بين الآبار المكررة. يمكنك ضبط الحد الأدنى يدويًا إلى موضع مناسب والنقر فوق تحليل. بعد ذلك، يمكنك التحقق مبدئيًا مما إذا كان منحنى التضخيم طبيعيًا في مخطط متعدد المكونات.

8.2 في علامة التبويب "تحليل النتيجة"، راجع رسم المنحنى القياسي. تحقق من قيم المنحدر، ونقطة التقاطع مع المحور Y، وR2 والكفاءة. بالنسبة لمنحنى معياري طبيعي، R²>0.99؛ 90% ≤ Eff% ≤ 110%.

8.3 في 'عرض جدول البئر' في لوحة التحليل، يتم عرض تركيزات كل عينة في الكمية، والوحدة هي fg/μL، ويمكن تحويل الوحدات إلى pg/μL أو بيكو جرام/مل في تقرير التحليل.

الدليل