الإشريكية القولونية يتم استخدام مجموعة الكشف عن بقايا الحمض النووي للخلية المضيفة للتحليل الكمي لبكتيريا الإشريكية القولونية يتم تقليص الحمض النووي للخلية المضيفة في العينات الوسيطة والمنتجات شبه المصنعة والنهائية لمختلف المنتجات البيولوجية.

تعتمد هذه المجموعة على مسبار فلورسنت Taqman وطريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، والتي لها حد أدنى للكشف عن مستوى fg ويمكنها الكشف بشكل محدد وسريع عن البكتيريا القولونية المتبقية DNA الخلية. يجب استخدام المجموعة مع مجموعة تحضير عينة الحمض النووي المتبقي (رقم الكتالوج 18461ES).

تقرير التحقق

تحديد

عناصر

تخزين

يجب تخزين هذا المنتج في درجة حرارة -25~-15 درجة مئوية لمدة عامين.

يجب تخزين كلا من 41308-A و 41308-B في مكان محمي من الضوء.

نماذج الأجهزة القابلة للتطبيق

تشمل ولكن لا تقتصر على:

Bio-Rad: وحدة بصرية CFX96.

Thermo Scientific: ABI 7500؛ ABI Quant Studio 5.

تعليمات

1. الإشريكية القولونية. تخفيف معيار DNA وتحضير المنحنى القياسي

الإشريكية القولونية تم تخفيف DNA Control تدريجيًا باستخدام DNA Dilution Buffer الموجود في المجموعة^*، والتخفيف

التركيز هو 300 بيكو جرام/ميكرولتر، 30 بيكو جرام/ميكرولتر، 3 بيكو جرام/ميكرولتر، 300 بيكو جرام/ميكرولتر، 30 بيكو جرام/ميكرولتر.

انظر التعليمات التفصيلية أدناه:

• قم بإذابة محلول التحكم في الحمض النووي coliDNA ومحلول تخفيف الحمض النووي DNA على الثلج. بعد إذابته بالكامل، قم بالخلط بلطف باستخدام دوامة، ثم قم بطرده بسرعة منخفضة لمدة 10 ثوانٍ.
• قم بإخراج ستة أنابيب نظيفة بحجم 1.5 مل، ومميزة بـ Std0، وStd1، وStd2، وStd3، وStd4، وStd5.
• أضف 90 ميكرولترًا من محلول تخفيف الحمض النووي و10 ميكرولترًا من الحمض النووي القولوني إلى أنبوب الميكروفوج سعة 1.5 مل المسمى Std0، أي قم بتخفيفه إلى 3 نانوجرام/ميكرولتر. امزجه ثم قم بطرده مركزيًا لمدة 10 ثوانٍ. قم بتعبئة معيار الحمض النووي المخفف ويمكن تخزينه لفترة قصيرة (لا تزيد عن 3 أشهر) عند درجة حرارة -25~-15 درجة مئوية^**يرجى تجنب التجميد والذوبان المتكرر.
• أضف 90 ميكرولترًا من محلول تخفيف الحمض النووي إلى أنابيب أخرى^***ثم اتبع الإجراء أدناه للتخفيفات التسلسلية^****.

الجدول 1 التخفيف المتدرج القياسي

^*مطلوب ثلاثة آبار مكررة لكل تركيز. نطاق الكشف هو 30 fg/μL~300pg/μL ويمكن توسيع هذا النطاق.

^**لتقليل عدد مرات التجميد والذوبان المتكررة وتجنب التلوث، يوصى بتخزين عنصر التحكم في الحمض النووي في أجزاء صغيرة عند درجة حرارة -25~-15 درجة مئوية لأول مرة.

^***بمجرد إذابته، يمكن تخزين محلول تخفيف الحمض النووي عند درجة حرارة تتراوح من 2 إلى 8 درجات مئوية لمدة 7 أيام، وإذا لم يتم استخدامه لفترة طويلة، فيرجى تخزينه عند درجة حرارة تتراوح من -25 إلى -15 درجة مئوية.

^****تأكد من خلط القالب بالكامل، ثم رج الخليط بلطف لمدة تتراوح بين 15 ثانية إلى دقيقة واحدة لكل تخفيف متدرج.

2. إعداد التحكم في الاستخراج والاسترداد (ERC)

قم بضبط تركيز DNA E.coli في ERC حسب الحاجة (تم تحضير عينة ERC باستخدام 30 بيكو جرام DNA E.coli كمثال)، على النحو التالي:

• أضف 100 ميكرولتر من عينة الاختبار إلى أنبوب نظيف سعة 1.5 مل، ثم أضف 10 ميكرولتر من 3 بيكو جرام/ميكرولتر من E.coli DNA Standard (Std3) واخلط جيدًا، مع وضع علامة ERC عليه.
• قم بإجراء استخراج الحمض النووي لعينة ERC مع عينات الاختبار لإعداد عينة ERC النقية.

3. إعداد محلول التحكم السلبي (NCS)

قم بضبط التحكم السلبي في التجربة، وخطوات التشغيل المحددة هي كما يلي:

1) أضف 100 ميكرولتر من مصفوفة العينة (أو محلول تخفيف الحمض النووي) إلى أنبوب نظيف سعة 1.5 مل، ثم قم بتمييزه بعلامة NCS.

2) قم بإجراء استخراج الحمض النووي لعينة NCS مع عينات الاختبار لإعداد عينة NCS النقية.

4. لا يوجد تحضير للتحكم بالقالب (NTC)

قم بتعيين عنصر التحكم "بدون قالب" في التجربة، وتكون خطوات التشغيل المحددة كما يلي:

1) لا يتطلب NTC أي معالجة مسبقة للعينة، ويمكن تكوينه في مرحلة اكتشاف qPCR للحمض النووي المتبقي.

2) عينة NTC في كل أنبوب أو بئر هي 20 ميكرولتر من الخليط (أي 15 ميكرولتر من خليط qPCR الخاص بـ E.coli + 5 ميكرولتر من خليط البادئ والمسبار الخاص بـ E.coli) + 10 ميكرولتر من عازل تخفيف الحمض النووي. يوصى بتكوين ثلاث آبار مكررة.

5. نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل

الجدول 2 نظام التفاعل

^*احسب الحجم الإجمالي لتفاعل PCR بعدد التفاعلات: qPCR Mix =(عدد التفاعلات +2) × (15+5) ميكرولتر (بما في ذلك خسائر بئري التفاعل). يوصى بأكثر من ثلاث تكرارات لكل عينة في التجربة.

^**بعد تغطية الأنبوب أو إحكام غلق اللوحة، قم بطرد أنبوب التفاعل أو اللوحة بسرعة منخفضة لمدة 10 ثوانٍ. بعد رجها وخلطها لمدة 5 ثوانٍ، كرر عملية الطرد المركزي لجمع السائل من الغطاء أو الجدار إلى القاع. تجنب الفقاعات أثناء التشغيل.

انظر الجدول أدناه لإعداد اللوحة الموصى بها:

جدول 3 لوحة مرجعية على الكمبيوتر

يتضمن تخطيط اللوحة: 5 Std (المنحنى القياسي لـ 5 تركيزات قياسية)، 1 NTC (تحكم بدون قالب)، 1 NCS (محلول تحكم سلبي)، 3 TS (عينات اختبار)، 3 ERC (تحكم في الاستخراج والاسترداد).ثلاثة آبار مكررة لكل عينة.

6. يثبت إرشادات لأداة تفاعل البوليميراز المتسلسل(طريقة مكونة من خطوتين) (على سبيل المثال، جهاز Thermo ABI 7500 qPCR، برنامج الإصدار 2.0)

تنطبق الإرشادات التالية فقط على جهاز Thermo ABI 7500 qPCR (إصدار البرنامج 2.0). إذا كنت تستخدم جهازًا مختلفًا، فراجع دليل الجهاز المعمول به للحصول على إرشادات الإعداد.

1) إنشاء تجربة جديدة، واختيار قالب الكم المطلق أو المحدد من قبل المستخدم.

2) قم بإنشاء مسبار كشف واحد، باسم "E.coli-DNA"، ثم حدد الفلوروفور المراسل على أنه "FAM" وأطفئ الفلوروفور على أنه "None". الفلورة المرجعية هي "ROX" (يمكن أن تكون الفلورة المرجعية بناءً على طراز الجهاز، إلخ، حدد ما إذا كنت بحاجة إلى إضافتها).

3) في جزء "العينات"، أضف جميع معلومات العينات بالترتيب. ثم حدد الآبار، واختر الهدف والعينات وفقًا لذلك. اضبط مهمة E.coli معيار الحمض النووي كمعيار، وقم بتعيين القيم 300000، 30000، 3000، 300، 30 (وحدة تركيز الحمض النووي في كل بئر هي fg/μL) في عمود الكمية، وقم بتسمية الآبار بالمعيار 1، معياري 2، معياري 3، معياري 4، معياري 5، وفقًا لذلك. اضبط مهمة NTC على أنها NTC. اضبط NCS وTS وERC كـ "غير معروف"، ثم قم بتسميتهم وفقًا لتخطيط اللوحة أعلاه. ثم انقر فوق "التالي".

4) ضبط برنامج التضخيم: ضبط حجم التفاعل إلى 30 ميكرولترًا.

الجدول 4 إجراءات التضخيم

7. تحليل نتائج qPCR

1) سيعطي النظام تلقائيًا الحد الأدنى في لوحة مخطط التضخيم في التحليل. في بعض الأحيان، تكون الحد الأدنى الذي يعطيه النظام قريبًا جدًا من خط الأساس، مما يؤدي إلى اختلاف كبير في Ct بين الآبار المكررة. يمكنك ضبط الحد الأدنى يدويًا إلى موضع مناسب والنقر فوق تحليل. بعد ذلك، يمكنك التحقق مبدئيًا مما إذا كان منحنى التضخيم طبيعيًا في مخطط متعدد المكونات.

2) في علامة التبويب "تحليل النتيجة"، راجع رسم المنحنى القياسي. تحقق من قيم R²الكفاءة، المنحدر والتقاطع مع المحور Y. بالنسبة لمنحنى معياري طبيعي، R²>0.99، 90% ≥ تأثير % ≥110%، -3.6 ≥ المنحدر ≥-3.1.

3) في جزء "عرض جدول البئر" في التحليل، يتم عرض تركيزات كل عينة في الكمية، والوحدة هي fg/μL، ويمكن تحويل الوحدات في تقرير التحليل.

4) يجب أن تعتمد إعدادات المعلمات لتحليل النتيجة على النموذج المحدد وإصدار البرنامج المستخدم، ويمكن تفسيرها بشكل عام تلقائيًا بواسطة الجهاز.

5) احسب معدل استرداد المسامير بناءً على نتائج اختبار TS للعينة المراد قياسها وERC لاسترداد المسامير في العينة، ويجب أن يكون معدل استرداد المسامير بين 50% إلى 150%.صيغة قياس معدل الاسترداد المتصاعد: الاسترداد (%) = {Sample spiked assay (eg.pg/μL) - Sample assay (eg.pg/μL)} x حجم الإيلوشن (ميكرولتر) / القيمة النظرية لكمية إضافة الحمض النووي (على سبيل المثال، بيكو جرام) × 100٪.

6) يجب أن تكون قيمة Ct للتحكم السلبي NCS أكبر من متوسط ​​أدنى تركيز Ct للمعيار.

• يجب أن تكون قيمة التحكم في القالب الخالي من NTC غير محددة أو قيمة Ct ≥3

ملحوظات

1. هذا المنتج مخصص للاستخدام البحثي فقط.
2. يرجى العمل باستخدام المعاطف المخبرية والقفازات التي تستخدم لمرة واحدة، من أجل سلامتك.

3. يرجى قراءة هذا الدليل بعناية قبل استخدام هذا الكاشف، ويجب توحيد التجربة، بما في ذلك التعامل مع العينة، وإعداد نظام التفاعل وإضافة العينة.

4. تأكد من أن كل مكون تم مزجه بالكامل وتم طرده بسرعة منخفضة قبل الاستخدام.

يدوي