يتم استخدام مجموعة الكشف عن الفيروسات البطيئة القادرة على التكاثر (RCL) للكشف الكمي عن الفيروسات العدسية المتكاثرة قد يحدث في مجموعة متنوعة من المنتجات الخلوية المرتبطة بالفيروسات العدسية ناقلات المخاطر المحتملة.

تصمم هذه المجموعة مواد تمهيدية محددة لـ تسلسل جين VSV-G لبروتينات الغلاف الفيروسي العدسي. ويعتمد التقمان  المسبار الفلوري وطريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، والتي لها حد كشف مستوى 1 نسخة/ميكرولتر و يمكن الكشف عنها بشكل محدد وسريع خطر الفيروس البطيء القادر على التكاثر. تحتاج المجموعة إلى لاستخدامها مع مجموعة تحضير عينة الحمض النووي المتبقي (رقم القطعة 18461ES).

عناصر

* IC： داخلي يتحكم.

تخزين

يجب تخزين هذا المنتج في درجة حرارة -25~-15 درجة مئوية ل2 سنين.

يجب تخزين كلا من 41311-A و 41311-B في مكان محمي من الضوء.

ملائم أداة نماذج

تشمل ولكن لا تقتصر على: Bio-Rad: وحدة بصرية CFX96؛ Thermo Scientific: أيه بي آي 7500؛ ABI Quant Studio 5؛ خطوة ABI OnePlus.

تعليمات

1. الحمض النووي لـ RCL معيار تخفيف و معيار منحنى تحضير

تم تخفيف عنصر التحكم في الحمض النووي RCL تدريجيًا باستخدام محلول تخفيف الحمض النووي المقدم في المجموعة* ، والتخفيف التركيز هو 5×10E7 نسخ/ميكرولتر، 5×10E6 نسخ/ميكرولتر، 5×10E5 نسخ/ميكرولتر، 5×10E4 نسخ/ميكرولتر، 5×10E3 نسخ/ميكرولتر، 5×10E2 نسخ/ميكرولتر، 5×10E1 نسخ/ميكرولتر.

انظر التعليمات التفصيلية أدناه:

1) قم بإذابة عازل التحكم في الحمض النووي RCL ومخفف الحمض النووي على الثلج. بعد إذابته تماما، دوامة بلطف إلى امزج و قم بتشغيل جهاز الطرد المركزي بسرعة منخفضة لمدة 10 ثواني.

2) قم بإخراج سبعة أنابيب نظيفة بحجم 1.5 مل، ومميزة بـ Std0، وStd1، وStd2، وStd3، وStd4، وStd5، وStd6.

3) أضف 90 ميكرولتر من محلول تخفيف الحمض النووي و10 ميكرولتر من RCL DNA Control في أنبوب الميكروفوج بحجم 1.5 مل والمسمى Std0، أي   خفف إلى 5×10E7 نسخ/ميكرولتر. امزج و ثم قم بالطرد المركزي لمدة 10 ثوانٍ. قم بتعبئة معيار الحمض النووي المخفف ويمكن أن يكون يتم تخزينها لمدة قصيرة (لا تزيد عن 3 أشهر) عند درجة حرارة -25~-15 درجة مئوية** يرجى تجنب التجميد والذوبان المتكرر.

4) أضف 90 ميكرولتر من محلول تخفيف الحمض النووي في أنابيب أخرى *** ثم اتبع الإجراء أدناه التخفيفات التسلسلية**** .

الجدول 1 التخفيف المتدرج القياسي

*ثلاثة تكرار الآبار نكون مطلوب ل كل التركيز. كشف يتراوح يكون 5×10E1 نسخ/ميكرولتر~5×10E6 نسخ/ميكرولتر و هذا يتراوح يستطيع يكون توسيعها إذا لزم الأمر.

** ل يقلل ال رقم ل يكرر تجميد-ذوبان و يتجنب التلوث، هو يكون مُستَحسَن ل محل ال الحمض النووي يتحكم في أجزاء صغيرة في -25~-15 درجة مئوية ل ال أولاً وقت.

*** مرة واحدة مذاب الحمض النووي تخفيف المخزن المؤقت استطاع يكون مخزنة في 2-8 درجة مئوية ل 7 أيام إذا لا مستخدم ل أ طويل الوقت من فضلك محل في -25~-15 درجة مئوية .

**** يصنع بالتأكيد ال نموذج يكون بالكامل مختلط بلطف هزة ال خليط ل 15 ثانية ل 1 دقيقة ل كل التدرج تخفيف.

2. الاستخراج والاسترداد يتحكم (المجلس الأوروبي للبحوث) تحضير

قم بضبط تركيز الحمض النووي RCL في ERC حسب الحاجة (تم تحضير عينة ERC باستخدام 5×10E4 نسخ الحمض النووي RCL كما (على سبيل المثال)، على النحو التالي:

1) أضف 100 ضع عينة اختبار ميكرولتر في أنبوب نظيف سعة 1.5 مل، ثم أضف 10 ميكرولتر 5×10E3 نسخ/ميكرولتر من معيار الحمض النووي RCL (Std4) و امزج جيدًا، مع وضع علامة ERC عليه.

2) قم بإجراء استخراج الحمض النووي لعينة ERC مع عينات الاختبار لإعداد عينة ERC النقية.

3. التحكم السلبي حل (مركز التحكم الوطني) تحضير

قم بضبط التحكم السلبي في التجربة، وخطوات التشغيل المحددة هي كما يلي:

1) أضف 100 ميكرولتر من مصفوفة العينة (أو محلول تخفيف الحمض النووي) في أنبوب نظيف سعة 1.5 مل، ثم يتم وضع علامة عليه NCS.

2) إجراء عملية استخراج الحمض النووي من NCS العينة مع عينات الاختبار لإعداد NCS المنقى عينة.

4. لا يوجد قالب يتحكم (المركز الوطني للبحوث) تحضير

قم بتعيين عنصر التحكم "بدون قالب" في التجربة، وتكون خطوات التشغيل المحددة كما يلي:

1) لا يتطلب NTC أي معالجة مسبقة للعينة، ويمكن تكوينه في مرحلة اكتشاف qPCR للحمض النووي المتبقي محتوى.

2) عينة NTC في كل أنبوب أو بئر هي 20 ميكرولتر من الخليط (أي 15 ميكرولتر من مزيج RCL qPCR + 4 ميكرولتر ار سي ال التمهيدي والمسبار مزيج + 1 ميكرولتر من IC) + 10 ميكرولتر من محلول تخفيف الحمض النووي. يوصى بتكوين ثلاث آبار مكررة.

5. تفاعل البوليميراز المتسلسل رد فعل نظام

الجدول 2 نظام التفاعل

* احسب ال المجموع تفاعل البوليميراز المتسلسل رد فعل مقدار بواسطة ال رقم ل التفاعلات: qPCR مزج =(ال رقم ل ردود الفعل+2) × (15+4+1) ميكرولتر (بما في ذلك ال خسائر (بئرين للتفاعل). يوصى بإجراء أكثر من ثلاث تكرارات لكل عينة في التجربة.

** بعد تغطية ال أنبوب أو ختم ال صفيحة الطرد المركزي ال رد فعل أنبوب أو طبق في قليل سرعة ل 10 ثواني بعد كافٍ اهتزاز و خلط ل 5 ثواني، كرر جهاز الطرد المركزي ل يجمع ال سائل من ال غطاء أو حائط ل ال أسفل. تجنب فقاعات خلال عملية.

انظر الجدول أدناه لإعداد اللوحة الموصى بها:

الجدول 3 - الكمبيوتر مرجع سبورة

يتضمن تخطيط اللوحة: 6 Std (المنحنى القياسي لـ 6 تركيزات قياسية)، 1 NTC (بدون تحكم في القالب)، 1 NCS (محلول التحكم السلبي)، 3 TS (عينات الاختبار)، 3 ERC (التحكم في الاستخراج والاسترداد).ثلاث آبار مكررة لـ كل عينة.

6. إرشادات الإعداد ل أ تفاعل البوليميراز المتسلسل أداة

تنطبق التعليمات التالية فقط على ثيرمو جهاز ABI 7500 qPCR (برنامج) الإصدار 2.0). إذا انت تستخدم أداة مختلفة، راجع دليل الأداة المعمول به للحصول على إرشادات الإعداد.

1) إنشاء تجربة جديدة، واختيار قالب الكم المطلق أو مُحددة من قبل المستخدم.

2) قم بإنشاء مسبار كشف واحد، باسم "RCL-DNA"، ثم حدد الفلوروفور المراسل كـ "FAM" وأطفئ الفلوروفور كـ "لا شيء"؛ قم بإنشاء مسبار اكتشاف آخر، وسمه "IC" وحدد الفلوروفور المراسل باسم "CY5" وقم بإخماده الفلوروفور كـ "لا شيء". "الفلورسنت المرجعي هو ROX" (يمكن أن يعتمد الفلورسنت المرجعي على نموذج الأداة، وما إلى ذلك، حدد سواء (يجب عليك إضافته).

3) في لوحة "العينات"، أضف جميع معلومات العينات بالترتيب. ثم حدد الآبار، واختر الهدف و العينات على التوالي. مهمة معيار RCL DNA كمعيار، وتعيين القيم 5000000، 500000، 50000، 5000، 500، 50 (وحدة تركيز الحمض النووي في كل بئر هي نسخ/ميكرولتر) في عمود الكمية، ثم قم بتسمية  الآبار المعيارية 1، المعيارية 2، المعيارية 3، المعيارية 4، المعيارية 5، المعيارية 6، على التوالي. اضبط مهمة NTC كـ NTC. اضبط NCS وTS وERC على غير معروفة، وتم تسميتها حسب تخطيط اللوحة أعلاه على التوالي. ثم انقر فوق التالي.

4) اضبط برنامج التضخيم: اضبط حجم التفاعل على 30 ميكرولترًا.

الجدول 4 إجراء التضخيم

7. تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي نتائج

1) النظام سيتم تلقائيًا إعطاء العتبة في لوحة رسم التضخيم التحليل. العتبة المعطاة في بعض الأحيان يكون النظام قريبًا جدًا من خط الأساس، مما يؤدي إلى اختلاف كبير في Ct بين الآبار المكررة. يمكنك التعديل يدويًا حدد العتبة إلى الموضع المناسب وانقر عليها قم بالتحليل. ثم يمكنك التحقق مبدئيًا ما إذا كان منحنى التضخيم طبيعيًا في الرسم البياني متعدد المكونات.

2) في النتيجة علامة التبويب "التحليل"، راجع رسم المنحنى القياسي. التحقق من القيم لـ R2 والكفاءة والمنحدر و نقطة التقاطع مع المحور Y. بالنسبة لمنحنى معياري طبيعي، R²>0.99، 90%≤Eff%≤110%، -3.6≤Slope≤-3.1.

3) في 'منظر لوحة "الجدول الجيد" في التحليل، يتم إظهار تركيزات كل عينة بالكمية، الوحدة نسخ/ميكرولتر، ويمكن تحويل الوحدات في تقرير التحليل.

4) إعدادات المعلمة يجب أن يعتمد تحليل النتيجة على النموذج المحدد والبرنامج إصدار تُستخدم، ويمكن تفسيرها عمومًا تلقائيًا بواسطة الأداة.

5) احسب معدل استرداد السنبلة بناءً على نتائج الاختبار العينة TS ليتم قياسها واختبار العينة معدل استرداد ERC، معدل استرداد المسامير مطلوبة أن تكون بين 50%~150%.صيغة مقياس معدل الاسترداد المسنن:

الاسترداد (%) = {Sample spiked assay (eg.copies/μL) - Sample assay (eg.copies/μL)} x حجم الايلوشن (ميكرولتر) / نظري قيمة كمية إضافة الحمض النووي (على سبيل المثال النسخ) × 100٪.

6) ال سي تي قيمة التحكم السلبي NCS يجب أن يكون أكبر من المتوسط أقل تركيز لـ Ct ال معيار.

7) قالب التحكم المجاني NTC يجب أن يكون غير محدد أو Ct القيمة ≥38.

ملحوظات

1. هذا المنتج مخصص للاستخدام البحثي فقط.
2. يرجى العمل باستخدام المعاطف المخبرية والقفازات التي تستخدم لمرة واحدة، من أجل سلامتك.

3.يرجى قراءة هذا الدليل بعناية قبل الاستخدام هذا الكاشف، ويجب أن تكون التجربة موحدة، بما في ذلك التعامل مع العينات وإعداد نظام التفاعل إضافة العينة.

4. تأكد من أن كل مكون تم مزجه بالكامل وتم طرده بسرعة منخفضة قبل الاستخدام.

يدوي