تم تصميم مجموعة تحليل شظايا الحمض النووي المتبقية من الخلايا المضيفة HEK293 لـ التحليل الكمي لبقايا الحمض النووي HEK293 بأطوال مختلفة في المنتجات الوسيطة وشبه المصنعة والمنتجات النهائية للمستحضرات البيولوجية. تستخدم هذه المجموعة مبدأ مسبار فلورسنت qPCR للكشف بشكل محدد وسريع عن بقايا الحمض النووي HEK293 سواء كانت أقل أو أعلى من 200 زوج قاعدي، مع حد كمي منخفض يصل إلى 10 fg/μL. كما تتضمن أيضًا عنصر التحكم في الحمض النووي HEK293 (مرجع كمي للحمض النووي). يمكن استخدام هذه المجموعة جنبًا إلى جنب مع مجموعات تحضير عينات الحمض النووي المتبقية القائمة على الخرز المغناطيسي للشركة (القطة رقم 18461ES/18462ES).

معلومات المنتج

عنصر

التخزين والشحن:

1. يتم شحن جميع المكونات على ثلج جاف ويجب تخزينها عند درجة حرارة تتراوح بين -25 درجة مئوية و-15 درجة مئوية عند الاستلام. مدة الصلاحية سنتان. يجب تخزين المكونات A وB1 وB2 وB3 وB4 في مكان محمي من الضوء.

2. عند الاستلام، تأكد من وجود جميع المكونات السبعة وقم بتخزينها على الفور في درجات الحرارة الموصى بها.

احتياطات:

1. هذا المنتج مخصص لأغراض البحث فقط.

2. لأسباب تتعلق بالسلامة والصحة، يرجى ارتداء المعاطف المخبرية والقفازات التي تستخدم لمرة واحدة أثناء التشغيل.

3. قبل استخدام هذا الكاشف، اقرأ دليل التعليمات بعناية. يجب إجراء التجارب وفقًا للإجراءات القياسية، بما في ذلك التعامل مع العينات، وإعداد مخاليط التفاعل، والتنقيط.

4. يجب خلط كل مكون جيدًا عن طريق رجّه بلطف وطرده مركزيًا لفترة وجيزة قبل الاستخدام.

الأجهزة المتوافقة:

بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الأدوات التالية: Thermo Scientific: ABI 7500، ABI Quant Studio 5، ABI Step OnePlus, Bio-Rad: وحدة بصرية CFX96, شنغهاي هونغشي التكنولوجيا الطبية: SLAN-96S

تعليمات الاستخدام

1. تخفيف كمية التحكم المرجعية لـ HEK293 DNA وإعداد المنحنيات القياسية

تتضمن مجموعة تحليل الشظايا HEK293 أربع شظايا تضخيم بأطوال مختلفة: 82 bp، و133 bp، و227 bp، و515 bp. عند إنشاء منحنيات قياسية، قم بإعداد منحنيات منفصلة لكل شظية تضخيم وحساب الكميات المتبقية والتوزيعات النسبية بناءً على المنحنيات القياسية المقابلة.

استخدم محلول تخفيف الحمض النووي الموجود في المجموعة لإجراء تخفيف تدريجي لمرجع التحكم الكمي للحمض النووي HEK293. يجب أن تكون تركيزات التخفيف: 3 نانوجرام/ميكرولتر، 300 بيكو جرام/ميكرولتر، 30 بيكو جرام/ميكرولتر، 3 بيكو جرام/ميكرولتر، 300 بيكو جرام/ميكرولتر، و30 بيكو جرام/ميكرولتر.

التفاصيل هي كما يلي

1)ضع محلول التحكم في الحمض النووي وتخفيف الحمض النووي HEK293 من المجموعة على الثلج ليذوب. بعد الذوبان الكامل، قم بالخلط بلطف باستخدام جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة (10 ثوانٍ) لجمع المحلول في قاع الأنبوب.

2)قم بإعداد ستة أنابيب طرد مركزي نظيفة بحجم 1.5 مل وقم بتسميتها بـ Std0، وStd1، وStd2، وStd3، وStd4، وStd5.

3)في الأنبوب المسمى Std0، أضف 90 ميكرولترًا من محلول تخفيف الحمض النووي و10 ميكرولتر من محلول التحكم في الحمض النووي HEK293 لتحقيق تركيز 3 نانوجرام/ميكرولتر. قم بالخلط بلطف باستخدام الدوامة وقم بالطرد المركزي لفترة وجيزة (10 ثوانٍ). يمكن تقسيم هذا التركيز وتخزينه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية للاستخدام قصير المدى (حتى 3 أشهر). تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة.

4). في الأنابيب التي تحمل العلامات Std0 وStd1 وStd2 وStd3 وStd4 وStd5، أضف أولاً 90 ميكرولترًا من محلول تخفيف الحمض النووي لكل منها. يجب خلط كل خطوة تخفيف برفق وطردها مركزيًا لفترة وجيزة لضمان التجانس. ثم قم بتنفيذ التدرج التخفيفات على النحو التالي:

الجدول 1: التخفيف المتدرج القياسي

* بالنسبة لكل تركيز، قم بإجراء 3 تكرارات. يمكن لهذا الكاشف الاختبار ضمن نطاق خطي يتراوح من 300 بيكو جرام/ميكرولتر إلى 30 بيكو جرام/ميكرولتر. إذا لزم الأمر، يمكن تمديد النطاق الخطي أو تضييقه بشكل مناسب.

** لتقليل دورات التجميد والذوبان المتكررة وتجنب التلوث، يوصى بتقسيم وتخزين كمية الحمض النووي سالمعيار هو -20 درجة مئوية للاستخدام الأول.

*** يمكن تخزين محلول الحمض النووي المذاب وغير المستخدم في درجة حرارة تتراوح بين 2 و8 درجات مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام. وإذا لم يتم استخدامه لفترة طويلة، يتم تخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية.

**** لضمان خلط القالب بشكل كامل، قم برج كل تخفيف متدرج بلطف لمدة دقيقة تقريبًا.

2. إعداد عينة الاختبار (TS)

قم بإعداد عينة الاختبار TS وفقًا لإعداد التجربة، على النحو التالي:

1) خذ 100 ميكرولتر من عينة الاختبار وأضفها إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 1.5 مل. ضع علامة TS عليها، وقم بإجراء المعالجة المسبقة للعينة، وقم بإعدادها.اوه نقيو ال عينة اختبار.

2) لتلبية متطلبات تحليل أربعة أطوال امتداد مختلفة في وقت واحد، يجب أن تكون كمية عينة الاختبار المعالجة مسبقًا ≥120 ميكرولتر. لذلك، يوصى بإعداد أنبوبين من كل عينة للمعالجة المسبقة، وبعد الاستخراج، مزجهما معًا للاستخدام.

3. إعداد التحكم في الاستخراج السلبي (NCS)

قم بإعداد وحدة التحكم بالاستخراج السلبي NCS وفقًا لإعداد التجربة، على النحو التالي:

1) خذ 100 ميكرولتر من محلول مصفوفة العينة (أو تخفيف الحمض النووي) المخزن المؤقت) وأضفه إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 1.5 مل. ضع علامة عليه باسم NCS.

2) قم بإجراء المعالجة المسبقة للعينة من NCS للتحكم السلبي مع دفعة عينات الاختبار وقم بإعداد محلول NCS للتحكم السلبي المنقى.

3) لتلبية متطلبات تحليل أربعة أطوال امتداد مختلفة في وقت واحد، يجب أن تكون كمية عينة NCS المعالجة مسبقًا ≥120 ميكرولتر. لذلك، يوصى بإعداد أنبوبين من كل عينة NCS للمعالجة المسبقة، وبعد الاستخراج، قم بخلطهما معًا للاستخدام.

4. إعداد عنصر التحكم بدون قالب (NTC)

قم بإعداد عنصر التحكم NTC بدون قالب وفقًا لإعداد التجربة، على النحو التالي:

1) لا يتطلب التحكم في القالب (NTC) عينة المعالجة المسبقة، ويمكن تحضيرها ابتداءً من مرحلة الكشف عن محتوى الحمض النووي المتبقي باستخدام qPCR.

2) لكل أنبوب أو بئر، تتكون عينة NTC من 20 ميكرولترًا من الخليط (أي 15 ميكرولترًا من خليط HEK293 qPCR + 5 ميكرولتر من خليط HEK293 Primer & Probe المقابل) + 10 ميكرولتر من عازل تخفيف الحمض النووي. يوصى بتحضير ما يكفي لثلاث آبار مكررة.

5. نظام تفاعل qPCR

طاولة 2. نظام التفاعل ل قطعة طولها 82 زوجًا أساسيًا

طاولة 3. نظام التفاعل لـ 133 جزء من BP

طاولة 4. نظام التفاعل ل227 جزء من BP

طاولة 5. نظام التفاعل لـ 515 جزء من BP

* لحساب الكمية الإجمالية للمزيج المطلوبة لهذا التفاعل بناءً على عدد الآبار:

المزيج = (عدد آبار التفاعل + 2) × (15 + 5) ميكرولتر (لحساب خسارة الآبارين). عادةً، يتم تحضير 3 آبار مكررة لكل عينة.

** عدد آبار التفاعل = (5 آبار منحنى معياري لتدرج التركيز + 1 بئر تحكم بدون قالب (NTC) + 1 محلول تحكم سلبي (NCS) + N عينة اختبار (TS)) × 3.

NTC (بدون تحكم بالقالب): عازل تخفيف الحمض النووي

NCS (محلول التحكم السلبي): محلول مصفوفة العينة أو محلول تخفيف الحمض النووي بعد تحليل العينة مسبقًا-علاج للحصول على المحلول المنقى وهو NCS.

TS (عينة الاختبار): العينة التي سيتم اختبارها.

***بعد توزيع العينات وإغلاق الأنابيب، قم بإجراء عملية الطرد المركزي بسرعة منخفضة (10 ثوانٍ) لفترة وجيزة لجمع السائل من جدران الأنابيب إلى القاع. ثم قم بالتدوير لمدة 5 ثوانٍ على الأقل لخلط السائل جيدًا. بعد ذلك، قم بإجراء عملية طرد مركزي أخرى بسرعة منخفضة (10 ثوانٍ). إذا كانت هناك أي فقاعات، فتأكد من إزالتها.

الجدول 6: تخطيط اللوحة المرجعية

هذا المثال يعرضهذا هو إجراء الكشف عن qPCR لتحليل أجزاء التضخيم من الحمض النووي HEK293 المتبقي.تتضمن عينات الاختبار: 5 تدرجات تركيز لمنحنى الحمض النووي HEK293 القياسي، وعينة اختبار واحدة (TS)، ومحلول تحكم سلبي واحد (NCS)، وعينة تحكم بدون قالب واحد (NTC). يوصى بتشغيل 3 آبار تكرار لكل عينة.

6. معلمات برنامج التضخيم (Tثلاثه-طريقة الخطوة ( (مثال باستخدام أداة ABI 7500 qPCR، إصدار البرنامج 2.0)**

1) قم بإنشاء برنامج فارغ جديد وحدد "التحديد الكمي المطلق" كقالب للكشف.

2) بالنسبة لأطوال شظايا التضخيم الأربعة المختلفة، قم بإنشاء مجسات كشف جديدة، وأطلق عليها اسم "HEK293-82"، و"HEK293-133"، و"HEK293-227"، و"HEK293-515". حدد الفلوروفور المراسل على أنه "FAM" والفلوروفور المطفأ على أنه "none". اضبط الصبغة المرجعية للكشف على أنها "ROX" (قد تتم إضافة الصبغة المرجعية أو لا تتم إضافتها حسب طراز الجهاز وعوامل أخرى).

3) في لوحة "تعيين هدف(أهداف) للآبار المحددة"، اضبط حقل "المهمة" لآبار المنحنى القياسي على "قياسي"، وقم بتعيين القيم المقابلة في حقل "الكمية" على "300000"، "30000"، "300"، "30" (تمثل تركيز الحمض النووي لكل بئر، بوحدة fg/μL). قم بتسمية الآبار في حقل "اسم العينة" على أنها "300 بيكوغرام/ميكرولتر"، "30 بيكوغرام/ميكرولتر"، "3 بيكوغرام/ميكرولتر"، "300 بيكوغرام/ميكرولتر"، "30 بيكوغرام/ميكرولتر". بالنسبة لآبار NTC، اضبط "المهمة" على "NTC". بالنسبة لآبار NCS وTS، اضبط "المهمة" على "غير معروف"، وقم بتسمية الآبار "NCS" و"TS" في حقل "اسم العينة". بعد ضبط هذه المعلمات، انقر فوق "بدء التشغيل" لبدء تشغيل الجهاز.

4) إعدادات برنامج التضخيم: اضبط برنامج التضخيم المكون من ثلاث خطوات، بحجم تفاعل يبلغ 30 ميكرولترًا.

طاولة7. إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل

7. تحليل نتيجة qPCR

1) في لوحة "التحليل" ضمن "مخطط التضخيم"، سيقوم النظام تلقائيًا بتعيين "العتبة". في بعض الأحيان، تكون "العتبة" الافتراضية قريبة جدًا من خط الأساس، مما يتسبب في اختلاف كبير في Ct بين التكرارات. يمكنك ضبط "العتبة" يدويًا إلى موضع مناسب والنقر فوق "تحليل". في هذه المرحلة، يمكنك التحقق مبدئيًا من منحنيات التضخيم في "مخطط متعدد المكونات" لمعرفة ما إذا كانت طبيعية.

2) في لوحة "التحليل" ضمن "المنحنى القياسي"، يمكنك قراءة R² للمنحنى القياسي، وكفاءة التضخيم (Eff%)، والميل، والتقاطع. بالنسبة للمنحنى القياسي العادي: R² > 0.99، وكفاءة التضخيم (90% ≤ Eff% ≤ 110%)، والميل بين -3.6 و-3.1.

3) في لوحة "التحليل" ضمن "عرض جدول البئر"، يمكنك قراءة عمود "الكمية" لعينات التحكم بدون قالب (NTC) وعينات التحكم السلبية (NCS) وعينات الاختبار (TS)، مع الوحدة بوحدة fg/μL. ويمكن تحويل الوحدات لاحقًا في التقرير.

4) يجب أن تعتمد إعدادات المعلمات لتحليل النتائج على طراز الجهاز المحدد وإصدار البرنامج. عادةً، يمكن للجهاز تفسير النتائج تلقائيًا.

5) يجب أن تكون قيمة Ct للتحكم السلبي (NCS) أكبر من متوسط ​​قيمة Ct لأدنى تركيز للمنحنى القياسي.

6) يجب أن تكون نتيجة التحكم بدون قالب (NTC) "غير محددة" أو أن يكون لها قيمة Ct ≥ 32.

وثيقة

يدوي