تستخدم مجموعة اختبار أنواع الأكسجين التفاعلية كاشف نفاذ الخلايا 2',7'- ثنائي كلوروفلوريسين ثنائي الأسيتات (DCFDA) لتقييم أنواع الأكسجين التفاعلية كميًا في عينات الخلايا الحية. يعبر DCFDA غير الفلوري المحب للدهون غشاء الخلية بسهولة من خلال الانتشار السلبي متبوعًا بإزالة الأسيتيل. المنتج منزوع الأسيتيل هو 2',7'- ثنائي كلوروفلوريسين (DCHF) حساس للأكسدة. يتأكسد DCHF لاحقًا بواسطة ROS لتكوين DCF. DCF شديد الفلورسنت ويمكن اكتشافه بواسطة مطيافية الفلورسنت أو قياس التدفق الخلوي مع الإثارة / الانبعاث عند 480 نانومتر / 525 نانومتر. Rosup، وهو مزيج مركب، هو محفز لـ ROS ويمكن استخدامه كعنصر تحكم إيجابي.

مكونات المنتج

الشحن والتخزين

يتم شحن هذه المجموعة مع كيس ثلج. قم بتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية بدون ضوء لمدة عام واحد. تجنب التجميد والذوبان المتكرر.

طريقة التطبيق

1. تحضير الكواشف
محلول DCFH-DA: قم بعملية الطرد المركزي بسرعة منخفضة قبل الفتح. قم بإعداد محلول DCFH-DA فعال عن طريق تخفيف 10 مليمولار من DCFH-DA في وسط خالٍ من المصل للحصول على تركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومولار.
[ملاحظة]: يمكن أيضًا تخفيف DCFH-DA في وسط لا يحتوي على أحمر الفينول. استخدم محلول DCFH-DA المحضر حديثًا، ولا يُنصح بتخزين DCFH-DA المخفف لفترة طويلة. سيعتمد التركيز الدقيق المطلوب من DCFH-DA على سلالة الخلية المستخدمة، ولكن النطاق الأولي العام سيكون 10-50 ميكرومولر. بالنسبة لخلايا معينة، إذا كانت فلورسنت التحكم السالب (بدون مسبار DCFH-DA) قوية جدًا، قم بتخفيف DCFH-DA إلى 2-5 ميكرومولر وتقصير وقت الحضانة بشكل مناسب.
محلول روسوب: قم بإعداد محلول روسوب العامل بتركيز 100 ميكرومولار عن طريق تخفيف محلول روسوب الأصلي بتركيز 100 مليمولار في وسط خالٍ من المصل. بشكل عام، يمكن أن يؤدي الحضانة مع روسوب عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى 4 ساعات في الظلام إلى زيادة مستويات الأكسجين التفاعلية بشكل كبير.
[ملاحظة]: يعتمد وقت حضانة روسوب على حساسية سلالة الخلية. على سبيل المثال، 30 دقيقة لـ هيلا و1.5 ساعة لـ إم آر سي 5. إذا لم يتم ملاحظة زيادة أنواع الأكسجين التفاعلية في غضون 30 دقيقة، فيمكن زيادة وقت الحث أو التركيز بشكل مناسب. إذا ارتفعت أنواع الأكسجين التفاعلية بسرعة كبيرة، فيمكن تقليل وقت الحث أو التركيز بشكل مناسب.
الأدوية: قم بإعداد الدواء المطلوب في وسط كامل يحتوي على 10% من مصل البقر البقري أو أي محلول مناسب آخر للتركيز المطلوب.
2. البروتوكول الموصى به للخلايا الملتصقة
أ) تحضير الخلايا: تنمية الخلايا الملتصقة في وسط زراعة الخلايا القياسي في اليوم السابق للتجربة بحيث يصل التقاء الخلايا إلى 70٪ في وقت التجربة.
ب) تحفيز الدواء: قم بإزالة الوسائط. ضع فوق كل بئر أدوية مخففة خالية من المصل تم تحضيرها مسبقًا واحتضنها للوقت المطلوب عند 37 درجة مئوية في الظلام.
ج) (اختياري) التحكم الإيجابي: ضع فوق بئر التحكم الإيجابي محلول روسوب المحضر مسبقًا واحتضنه لمدة زمنية مرغوبة عند 37 درجة مئوية في الظلام.
[ملاحظة]: بالنسبة للخلايا ذات وقت التحفيز القصير (عادةً في غضون ساعتين)، يمكن أيضًا تحميل المسبار أولاً، ثم إضافة Rosup أو دواء آخر ذي أهمية.
د) تحميل مسبار ROS: قم بإزالة جميع الوسائط واغسل الخلايا بوسط خالٍ من المصل لمدة 1-2 مرة. ضع فوق كل بئر محلول DCFH-DA المُعد مسبقًا. احتضن في درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
هـ) قم بإزالة الوسط ثم اغسل الخلايا 1-2 مرة باستخدام وسط خالٍ من المصل لإزالة DCFH-DA الحر.
3. البروتوكول الموصى به لخلايا التعليق
أ) تحضير الخلايا: قم بتنمية خلايا التعليق إلى ما يقرب من 1.5 × 105 خلية لكل بئر في يوم التجربة.
ب) تحفيز الدواء: يتم جمع الخلايا في أنبوب مخروطي الشكل عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليقها في كمية مناسبة من الأدوية المخففة الخالية من المصل والتي تم تحضيرها مسبقًا ويتم حضنها للوقت المطلوب عند 37 درجة مئوية في الظلام.
ج) (اختياري) التحكم الإيجابي: يتم إعادة تعليق خلايا التحكم الإيجابي بمحلول روسوب المحضر مسبقًا ويتم الحضن للوقت المطلوب عند 37 درجة مئوية في الظلام.
د) تحميل مسبار ROS: اجمع الخلايا في أنبوب جديد واغسلها بالطرد المركزي مرتين في PBS. أعد تعليق الخلايا بمحلول DCFH-DA المُعد مسبقًا بكثافة خلايا تبلغ 1×106-2×107/mL. ثم احتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام. اقلب الأنبوب كل 3-5 دقائق لضمان الاتصال الكامل بين المسبار والخلايا.
[ملاحظة]: يجب تعديل كثافة الخلايا وفقًا لطريقة الكشف اللاحقة. على سبيل المثال، بالنسبة لقياس التدفق الخلوي، لا ينبغي أن يكون عدد الخلايا في الأنبوب الواحد أقل من 104/مل أو أكثر من 106/مل.
هـ) جمع الخلايا وغسلها عن طريق الطرد المركزي مرتين باستخدام وسط خالٍ من المصل لإزالة DCFH-DA الحر.
4. الكشف عن الفلورسنت وتحليل البيانات
القياس بالمجهر الفلوري: قم بإجراء فحص مجهري للخلايا الحية باستخدام مجموعة مرشحات مناسبة للفلوريسين (FITC) باستخدام مجهر فلوري. قم بتقييم الخلايا بصريًا من حيث السطوع وقارن بين العينة الضابطة والعينات أو استخدم طرق تحليل الصور لمقارنة الإشارات بين الصور الرقمية للخلايا.
قياس التدفق الخلوي: يجب جمع الخلايا الملتصقة باستخدام التربسين لإعداد معلق خلوي واحد؛ بالنسبة لخلايا التعليق، يتم جمع الخلايا مباشرة. من الناحية المثالية، يجب تحليل 10000 خلية لكل حالة تجريبية. يجب ألا تكون الخلايا كثيفة بشكل مفرط أثناء التجربة (<1 × 106 خلية / مل). استبعد الحطام وعزل مجموعة الخلايا ذات الأهمية باستخدام البوابات. باستخدام متوسط ​​شدة الفلورسنت، حدد التغير في الطيات بين العينات الضابطة والمعالجة مع Ex / Em = 480/525 نانومتر.
قياس اللوحة الميكروية الفلورية: قم بقياس اللوحة فورًا على قارئ اللوحة الفلورية عند Ex/Em = 480/525 نانومتر في وضع نقطة النهاية في وجود الوسائط. اطرح القراءات الفارغة من جميع القياسات وحدد التغير في الطي من التحكم في الاختبار.

تحذيرات

1. اغسل الخلايا بعد الحضانة باستخدام DCFH-DA لتقليل الضوضاء الخلفية.
2. يوصى بقياس الفلوريسنت في أقرب وقت ممكن بعد الحضانة لتجنب الأخطاء المحتملة.
3. من أجل سلامتك وصحتك، يرجى ارتداء المعاطف المخبرية والقفازات التي تستخدم لمرة واحدة أثناء إجراء العملية.
4. للاستخدام البحثي فقط!