البرومايسين هو مضاد حيوي أمينوغليكوزيدي يتم إنتاجه عن طريق تخمير واستقلاب Streptomyces alboniger، والذي يقتل البكتيريا إيجابية الجرام، وخلايا الحيوانات والحشرات المختلفة عن طريق تثبيط تخليق البروتين. البرومايسين فعال ضد الإشريكية القولونية في بعض الحالات. الآلية هي أن بوروميسين هو نظير للطرف الثالث لجزيئات aminoyl-TrNA، والذي يمكنه الارتباط بموقع A في الريبوسوم ودمجه في سلسلة الببتيد الممتدة. بعد ارتباط البيوروميسين بموقع A، لن يشارك في أي تفاعلات لاحقة، مما يؤدي إلى إنهاء مبكر لتخليق البروتين وإطلاق البولي ببتيدات غير ناضجة تحتوي على البيوروميسين عند الطرف C.

إن جين pac الموجود في Streptomyces alboniger من البكتيريا المنتجة للبيورومايسين يشفر إنزيم puromycin N-acetyltransferase (PAC)، والذي يمكن أن يمنح مقاومة للبيورومايسين. تُستخدم هذه الميزة الآن بشكل شائع في فحص سلالات الخلايا الثديية المحددة التي تم تحويلها بشكل ثابت والتي تحمل البلازميدات التي تحمل جين pac.

إن الاستخدام العام للبيورومايسين في فحص السلالات المستقرة للخلايا مرتبط بخصائص النواقل الفيروسية البطيئة، وتحمل أغلب النواقل الفيروسية البطيئة التجارية الآن جينات pac. وفي بعض الحالات المحددة، يمكن أيضًا استخدام البيورومايسين لفحص سلالات الإشريكية القولونية المتحولة التي تحمل بلازميد جين pac.

هذا المنتج عبارة عن محلول معقم من هيدروكلوريد البيوروميسين مذاب في الماء المقطر، بتركيز 10 ملغ/مل (10 ملغ/مل في H2O).₂O)، يمكن تخفيفه مباشرة باستخدام وسط ثقافي أو محلول منظم آخر، مناسب لثقافة الخلايا، تركيز العمل الشائع 1-10 ميكروجرام/مل.

بالإضافة إلى ذلك، توفر شركة Yeasen أيضًا هيدروكلوريد البيوروميسين (رقم القط # 60210ES) على شكل مسحوق، وهو في حالة مختلفة ولكن له نفس الوظيفة.

سمات

نقاء≥98%

معقم

التطبيقات

مناسبة لزراعة الخلايا

سسلالات الخلايا الثديية المعدلة وراثيًا والمحددة وراثيًا والتي تحمل البلازميدات التي تحمل جين pac

شاشة ال سلالات E. coli المحولة التي تحمل بلازميد جين pac

تحديد

عناصر

الشحن والتخزين

ال صيوروميسين (10 ملغ/مل في المحلول) يجب تخزين المنتجات عند درجة حرارة -15 درجة مئوية ~ -25 درجة مئوية ل 1 سنين.

تعليمات

1. التركيز العملي المقترح

الخلايا الثديية: 1-10 ميكرومترجرام/مل، يجب تحديد التركيز الأمثل عن طريق منحنى القتل.

Escherichia coli: تم استخدام وسط أجار LB لفحص Escherichia coli المتحولة بشكل ثابت باستخدام جين pac بتركيز 125 ميكرومترجرام/مل.

ملحوظة: يتطلب فحص سلالات الإشريكية القولونية المستقرة باستخدام البيوروميسين تعديلًا دقيقًا لدرجة الحموضة.

التركيزات الموصى بها من بوروميسين هيدروكلوريد

2. تحديد بوروميسين منحنى القتل (مع الأخذ في الاعتبار انتقال shRNA أو انتقال الفيروس العكوس كمثال)

تركيز الفحص الفعال لـ بوروميسين يتعلق بنوع الخلية وحالة النمو وكثافة الخلية واستقلاب الخلية وموضع دورة الخلية.من أجل فحص سلالات الخلايا shRNA ذات التعبير المستقر، من الضروري تحديد الحد الأدنى لتركيز البيوروميسين الذي يقتل الخلايا غير المحولة/المحولة. يوصى بأن يقوم العملاء الذين يقومون بالتجارب لأول مرة بإنشاء منحنى قتل مناسب لنظامهم التجريبي الخاص.

1) اليوم الأول: يتم طلاء اللوحة المكونة من 24 بئرًا بكثافة 5-8×104 خلية/بئر، وتم وضع عدد كافٍ من الآبار للتجارب اللاحقة للتدرج. تم حضانة الخلايا طوال الليل عند 37 درجة فهرنهايت.درجة مئوية.

2) اليوم الثاني: أ) تحضير وسط الفحص: وسط طازج يحتوي على تركيزات مختلفة من البيوروميسين (مثل 0-15 ميكرومترب) ضع وسط الفحص المحضر حديثًا في الخلايا بعد الحضانة طوال الليل؛ ثم يتم حضانة الخلايا عند 37 درجة فهرنهايت (18 درجة مئوية).درجة مئوية.

3) اليوم الرابع: استبدل بوسط اختيار جديد ولاحظ حيوية الخلايا.

4) اعتمادًا على حالة نمو الخلايا، قم بالتغيير إلى وسط اختيار جديد كل 2-3 أيام.

5) تمت مراقبة الخلايا يوميًا لمراقبة معدل الخلايا القابلة للحياة لتحديد أقل تركيز للدواء الفعال لقتل الخلايا غير المحولة أو جميع الخلايا غير المحولة خلال 4-6 أيام من بدء فحص المضادات الحيوية.

3. فحص سلالات الخلايا الثديية المستقرة المحولة وراثيا

بعد تحويل البلازميد الذي يحتوي على جين pac، تم نشر الخلايا في وسط يحتوي على البيوروميسين لاختيار الخلايا المحولة المستقرة.

1) بعد 48 ساعة من التحويل الجيني، تتم زراعة الخلايا (الأصلية أو المخففة) في وسط جديد يحتوي على تركيز مناسب من البيوروميسين.

ملحوظة:تكون المضادات الحيوية أكثر فعالية عندما تكون الخلايا في حالة انقسام نشط. وإذا كانت الخلايا كثيفة للغاية، فسوف تقل فعالية المضادات الحيوية بشكل كبير. ومن الأفضل أن يتم تطعيم الخلايا بكثافة لا تزيد عن 25%.

2) قم بإزالة واستبدال وسط الثقافة المحتوي على بوروميسين كل 2-3 أيام.

3) يتم تقييم البؤر المكونة للخلايا بعد 7 أيام من الفحص. قد تتطلب الآفات أسبوعًا إضافيًا أو أكثر، اعتمادًا على سلالة الخلايا المضيفة وكفاءة فحص النقل.

ملاحظة: راقب حالة نمو الخلايا كل يوم. يتطلب فحص البيوروميسين 48 ساعة على الأقل، وتتراوح فترة فحص التركيز الفعال للبيورومايسين عمومًا بين 3 و10 أيام.

4) انقل 5-10 استنساخات مقاومة وضعها في طبق بتري مقاس 35 مم واستمر في الزراعة باستخدام وسط اختيار لمدة 7 أيام. هذه الثقافة الإثراءية هي للتحضير لتجربة السمية الخلوية المستقبلية.

وثائق:

ورقة بيانات السلامة

60209_بيانات سلامة المواد_HB220420_AR.pdf

الدليل

60209_دليل_HB250114_AR.pdf

الاستشهادات والمراجع:

[1] Furge KA. et al., 2001. قمع الأورام السرطانية التي يسببها بروتين Ras والنقائل من خلال تثبيط مستقبلات التيروزين كيناز Met. PNAS 98:10722-7.

[2] Díaz J. et al., 2014. Rab5 مطلوب في خلايا السرطان النقيلي لتنشيط Rac1 المعزز بـ Caveolin-1 والهجرة والغزو. J Cell Sci. 127:2401-6.

[3] Rössger K. et al., 2013. التحكم في ارتفاع ضغط الدم القائم على المكافأة من خلال واجهة اصطناعية بين الدماغ والدوبامين. PNAS، 110:18150-5.

[4] كامير آي وآخرون، 2005. إن BID المؤيد للموت الخلوي المبرمج هو أحد عوامل ATM في استجابة تلف الحمض النووي. الخلية. 122: 593-603.

[5] Charnaux N. et al., 2005. RANTES (CCL5) يحفز تساقطًا متسارعًا معتمدًا على CCR5 للسينديكان-1 (CD138) والسينديكان-4 من خلايا HeLa ويشكل.

[6] Gao J, Zhao N, Knutson MD, et al. The Hereditary Hemochromatosis Protein, HFE, Inhibits Iron Uptake via Down-regulation of Zip14 in HepG2 Cells[J]. مجلة الكيمياء الحيوية، 2008، 283(31):21462-8.

[7] Huang J, Dibble CC, Matsuzaki M, et al. إن مركب TSC1-TSC2 مطلوب للتنشيط السليم لـ mTOR2[J]. علم الأحياء الجزيئي والخلوي، 2008، 28(12):4104-4115.

[8] ناصر MW، داتا J، نوفو G، وآخرون. ناصر MW، داتا J، نوفو G، كوتاي H، موتيوالا T، ماجومدار S، وانغ B، سوستر S، جاكوب ST، غوشال K التنظيم السلبي لـ micro-RNA-1 (miR-1) في سرطان الرئة. قمع الخاصية المسببة للورم في خلايا سرطان الرئة وتحسسها للموت الخلوي المبرمج الناجم عن الدوكسوروبيسين بواسطة miR-1. J Biol Chem 283: 33394-33405[J]. مجلة الكيمياء الحيوية، 2008، 283(48):33394-33405.

[9] باتيرو أو، هيلكا تي، هابونين إل جي، وآخرون. تكامل البكتيريا Mu في جينومات الخميرة والثدييات [J]. أبحاث الأحماض النووية، 2008، 36(22): e148-e148.

[10] Zhang D، وآخرون. مسار cGAS-STING-PERK غير التقليدي يسهل البرنامج الترجمي المهم للشيخوخة وتليف الأعضاء. Nat Cell Biol. 2022 مايو؛ 24(5): 766-782. doi: 10.1038/s41556-022-00894-z. Epub 2022 مايو 2. PMID: 35501370.

[11] Lu T، وآخرون. يحدد CD73 في الحويصلات خارج الخلية الصغيرة المشتقة من سرطان الخلايا الحرشفية للرأس والرقبة تثبيط المناعة المرتبط بالورم بوساطة الخلايا البلعمية في البيئة المحيطة. مجلة الحويصلات خارج الخلية. 2022 مايو؛ 11(5): e12218. doi: 10.1002/jev2.12218. PMID: 35524455؛ PMCID: PMC9077142.

[12] Chen S، وآخرون. تحديد البروتياز 32 الخاص باليوبيكويتين باعتباره أحد الأورام السرطانية في الورم الأرومي الدبقي والآليات الأساسية. Sci Rep. 2022 Apr 19;12(1):6445. doi: 10.1038/s41598-022-09497-y. PMID: 35440702؛ PMCID: PMC9018837.

[13] هان إل وآخرون. يرتبط بروتين الجلوبيولين الرحمي 1 (UGRP1) بالبودوبلانين (PDPN) لتعزيز مسار التهاب جديد أثناء الإصابة بالمكورات الرئوية. Clin Transl Med. 2022 يونيو؛ 12(6): e850. doi: 10.1002/ctm2.850.PMID: 35652821؛ PMCID: PMC9161880.

[14] Sun Q, et al. MORTALIN-Ca2+ axis drives innate rituximab resistant in diffuse large B-cell Lymphoma. Cancer Lett. 2022 Jul 1; 537:215678. doi: 10.1016/j.canlet.2022.215678. Epub 2022 Apr 18. PMID: 35447282.