كبريتات G418، والمعروفة أيضًا باسم كبريتات جينيتيسين، هي مضاد حيوي أمينو-جليكوزيدي ومشابهة هيكليًا لجنتاميسين B1. تتداخل مع تخليق البروتين عن طريق ربط الريبوسوم 80s ومنع خطوات الاستطالة. كبريتات G418 سامة لكل من الخلايا البدائية والحقيقية، بما في ذلك البكتيريا والخميرة والخلايا النباتية العليا والثديية، وكذلك الكائنات الأولية والديدان. جين المقاومة (النيو بشكل أساسي)، الموجود في الترانسبوزون Tn601 (903) أو Tn5، مشتق من البكتيريا، ولكن يمكن التعبير عنه في الخلايا حقيقية النواة. يمكن إدخال جين المقاومة إلى الخلايا من خلال تقنيات إعادة تركيب الجينات للحصول على مقاومة G418، والتي يمكن استخدامها لفحص والحفاظ على ثقافة الخلايا البدائية أو حقيقية النواة التي تحمل جين المقاومة.

في الخلايا الثديية، يشفر نيو التعبير عن إنزيم أمينو-جليكوسيد 3'-فوسفوترانسفيراز (APH (3') II) بعد دمجه في الجينوم حقيقيات النوى. يعمل هذا الإنزيم على تعطيل المضاد الحيوي عن طريق تعديل وظيفة الأمينو أو الهيدروكسيل لـ G418 تساهميًا وتثبيط تفاعل المضاد الحيوي مع الريبوسوم، مما يمنح الخلية مقاومة لـ G418. في تجارب فحص سلالات الخلايا المستقرة، يجب تحديد منحنيات القتل (منحنيات الاستجابة للجرعة) لتحديد الحد الأدنى للتركيز الفعال لقتل الخلايا غير المقاومة.

في الخلايا النباتية، يمكن الحصول على المقاومة عن طريق تحويل جين nptII إلى بلازميد مقاوم. يشفر جين nptII أيضًا إنزيم فوسفوترانسفيراز الأمينوغليكوزيد، وهو إنزيم يعمل على تعطيل العديد من المضادات الحيوية، بما في ذلك G418، والكاناميسين، والبالوميسين.

سمات

نقاء≥98%

الإنتاج الموحد، باستخدام نمط الإنتاج الضخم في المصنع

مجموعة واسعة من التطبيقات، والتي يمكن استخدامها في مجالات البيولوجيا الجزيئية والبحوث التجريبية الكيميائية الحيوية لزراعة الأنسجة

وتغطي منصة التعاون كامل

لضمان استقرار جودة المنتج، يتم التحكم في الفرق بين الدفعات بنسبة 1%

التطبيقات

فحص خطوط الخلايا المحولة بشكل مستقر

تحديد

عناصر

الشحن والتخزين

ال كبريتات G418 (جينيتيسين) يجب تخزين المنتجات عند درجة حرارة -15 درجة مئوية ~ -25 درجة مئوية ل 3 سنين.

تعليمات

1. تحضير محلول تخزين G418 (50 ملغ/مل، التركيز النشط)

1) تحويل وحدات النشاط

تم إجراء التحويل وفقًا لهذه الصيغة: (1000/A0) ×A1=A2

A0: قيمة فاعلية G418، والتي تختلف من دفعة إلى أخرى. راجع تقرير جودة الدفعة أو الملصق الموجود على الزجاجة.

ج1: تركيز G418 النشط الذي تريده.

أ2: التركيز الفعلي لـ G418.

على سبيل المثال، إذا كانت قيمة نشاط G418 للدفعة 750 وحدة/ملجم وكان التركيز النشط لـ G418 50 ملجم/مل، فإن تركيز المسحوق الفعلي المراد تحضيره هو 1000/750×50 ملجم/مل=66.67 ملجم/مل. إذا تم تحضير 10 مل من محلول تخزين G418 (تركيز نشط، 50 ملجم/مل)، فيجب وزن 666.7 ملجم من المسحوق.

2) التعقيم والحفظ

قم بوزن المسحوق الفعلي الذي تم الحصول عليه عن طريق التحويل أعلاه وأضف 10 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم لإذابته تمامًا.

قم بترطيب فلتر الإبرة 0.22 ميكرومتر مسبقًا بـ 5 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم، ثم قم بتعقيم محلول G418 عن طريق الترشيح.قم بتقسيم محلول G418 المعقم وقم بتخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية.

ملاحظة: ① لا تقم بترشيح المحلول العكر، حيث أن المحلول لم يذوب تمامًا، فإن عملية الترشيح ستتسبب في فقدان الدواء، مما يقلل من نشاط المحلول النهائي. ② لا ينصح باستخدام وسائط الثقافة أو محاليل الفوسفات أو المذيبات العضوية لإعداد محلول التخزين.

2. تركيز الفحص المستخدم بشكل شائع

بشكل عام، يلزم تركيز عالٍ من G418 في البداية لفحص المحولات واستخدام تركيز منخفض للحفاظ على الثقافة. قد تؤثر ظروف النمو وأنواع الخلايا والعوامل البيئية الأخرى على الجرعة الفعالة من G418، لذلك يوصى بتحديد تركيز الفحص الأمثل من خلال منحنى القتل (منحنى الاستجابة للجرعة).

بشكل عام، يتراوح نطاق فحص الخلايا الثديية بين 200-2000 ميكروجرام/مل، والخلية النباتية: 10-100 ميكروجرام/مل، وخلية الخميرة: 500-1000 ميكروجرام/مل.

بيانات التجارب الخلوية

3. إنشاء منحنى القتل

ملاحظة: من أجل فحص سلالات الخلايا ذات التعبير المستقر عن البروتينات المستهدفة، من الضروري تحديد الحد الأدنى من تركيز المضادات الحيوية التي يمكنها قتل الخلايا المضيفة غير المحولة. ويمكن تحقيق ذلك من خلال إنشاء منحنى قتل (منحنى الاستجابة للجرعة). يجب اختيار ستة تركيزات على الأقل. يكون G418 أكثر نشاطًا عند علاج الخلايا الانقسامية، لذلك يجب زراعة الخلايا لفترة من الوقت قبل إضافة G418.

1) اليوم الأول: توضع الخلايا غير المحولة على طبق زراعة مناسب بكثافة خلايا تتراوح بين 20-25% عند 37 درجة مئوية وتزرع طوال الليل في ثاني أكسيد الكربون₂؛

ملاحظة: بالنسبة للخلايا التي تتطلب كثافة أعلى لاكتشاف قابليتها للبقاء، يمكن زيادة كمية التطعيم.

2) اضبط تدرج تركيز G418 ضمن النطاق المناسب وفقًا لنوع الخلية. يمكن ضبط الخلايا الثديية عند 0، 50، 100، 200، 400، 800، 1000 ميكروجرام/مل.

3) اليوم الثاني: قم بإزالة الوسط القديم واستبدله بوسط جديد محضر حديثًا يحتوي على التركيز المناسب من الأدوية. اصنع ثلاثة وسطات متوازية لكل تركيز.

4) ثم قم باستبدالها بالوسائط الجديدة التي تحتوي على G418 كل 3-4 أيام.

5) يتم إجراء تعداد الخلايا الحية في دورة ثابتة (على سبيل المثال، كل يومين) لتحديد التركيز المناسب. اختر الحد الأدنى للتركيز، الذي يقتل غالبية الخلايا في غضون عدد مثالي من الأيام (عادةً 7-10 أيام)، باعتباره التركيز العامل لفحص الخلايا المستقرة عن طريق النقل الجيني.

4. فحص الخلايا المستقرة المحولة

1) بعد 48 ساعة من التحويل الجيني، تم استخدام وسط ثقافة G418 المحتوي على التركيز المناسب للثقافة الفرعية (ثقافة فرعية مباشرة أو ثقافة فرعية مخففة).

ملحوظة: للحصول على نتائج فحص جيدة، يوصى بتخفيف الخلايا بما لا يزيد عن 25% من الوفرة.

2) تغيير وسط الفحص المحتوي على الأدوية كل 3-4 أيام.

3) قم بقياس تكوين مستعمرة الخلايا بعد 7 أيام من الفحص. قد يستغرق تكوين المستعمرة أسبوعًا آخر أو أكثر، اعتمادًا على نوع الخلية المضيفة، والتحويل الجيني، وفعالية الفحص.

4) تم اختيار 5-10 استنساخات مقاومة ونقلها إلى أطباق زراعة الخلايا مقاس 35 مم، وتم زراعتها باستخدام وسط فحص يحتوي على الدواء لمدة 7 أيام.

5) استبدله بالوسط العادي.

وثائق:

ورقة بيانات السلامة

60220_بيانات سلامة المواد_HB220421_AR.pdf

الدليل

60220_دليل_HB250115_AR.pdf

الأرقام

الشكل 1.اختبار الاستقرار والتحقق من التركيز الفعال للجينوميسين بين دفعات مختلفة

السلالة التجريبية: E. coli

G69 و G99 هما دفعتان مختلفتان

تم تحديد تركيز استخدام الجينوميسين ليكون 8 ملغ/لتر، و12 ملغ/لتر، و16 ملغ/لتر على التوالي، وتم تحديد الحد الأدنى للتركيز الفعال ليكون 16 ملغ/لتر، مما أدى إلى تثبيط نمو البكتيريا المتنوعة بشكل مثالي. وكان أداء الدفعتين متسقًا.