هيجروميسين ب، وهو مضاد حيوي أمينوغليكوزيد تم تصنيعه بواسطة Streptomyces hygroscopicus، يثبط تخليق البروتين عن طريق التدخل في انتقال الريبوسوم 70S وتحفيز القراءة الخاطئة لقالب mRNA، وبالتالي قتل بدائيات النوى (مثل البكتيريا)، وحقيقيات النوى (مثل الخميرة والفطريات) وحقيقيات النوى الثدييات العليا.

جينات مقاومة الهيجرومايسين (hyg أو hph) المشتقة من الإشريكية القولونية تشفر فوسفوترانسفيراز الهيجرومايسين ب، الذي يزيل سموم الهيجرومايسين ب إلى منتج فوسفوري غير نشط بيولوجيًا، مما يجعله علامة انتقائية ممتازة لفحص وزراعة الخلايا البدائية أو حقيقية النواة التي تم تحويلها بنجاح باستخدام جينات مقاومة الهيجرومايسين. بالإضافة إلى ذلك، نظرًا لطرق العمل المختلفة، غالبًا ما يستخدم الهيجرومايسين ب بالاشتراك مع G418 أو بلاستيسيدين إس لاختيار سلالات الخلايا المقاومة المزدوجة. يمكن أيضًا استخدام الهيجرومايسين ب كعامل مضاد للفيروسات لأنه يخترق بشكل انتقائي الخلايا ذات نفاذية الغشاء المتزايدة بسبب العدوى الفيروسية ويمنع الترجمة. يمكن أن يعمل أيضًا كطارد للحشرات عن طريق مزجه بأعلاف الحيوانات.

هذا المنتج عبارة عن محلول هيجروميسين ب معقم (50 ملغ/مل في محلول PBS) ويمكن تخفيفه مباشرة للاستخدام مع وسط الثقافة.

سمات

الإنتاج الموحد، باستخدام نمط الإنتاج الضخم في المصنع

التطبيقات

معقم

فحص خطوط الخلايا المحولة بشكل مستقر

تحديد

عناصر

الشحن والتخزين

ال هيجروميسين ب (50 ملغ/مل) يجب تخزين المنتجات في 2درجة مئوية ~ 8درجة مئوية ل 2 سنين.

تعليمات

1. تركيز الفحص المستخدم بشكل شائع

يجب أن يختلف تركيز هيجروميسين ب المستخدم لفحص سلالات النقل المستقرة حسب نوع الخلية والوسط وظروف النمو ومعدل التمثيل الغذائي للخلية، مع تركيزات موصى بها تتراوح بين 50-1000 ميكرومترجرام/مل. بالنسبة للنظام التجريبي الأول، يوصى باستخدام منحنى القتل (منحنى القتل)، ومنحنى تفاعل الجرعة، لتحديد تركيز الفحص الأمثل.

بشكل عام، الخلايا الثديية: 50-500 ميكرومترجرام/مل؛ الخلايا البكتيرية/النباتية: 20-200 ميكرومترجرام/مل؛ الفطريات: 300-1000 ميكرومترجرام/مل.

2. إنشاء منحنى القتل

ملاحظة: من أجل فحص خطوط الخلايا المستقرة، من الضروري تحديد الحد الأدنى لتركيز المضادات الحيوية القادرة على قتل الخلايا المضيفة غير المحولة وراثيًا. ويمكن تحقيق ذلك من خلال إنشاء منحنى قتل (منحنى الاستجابة للجرعة). ويجب ترتيب خمسة تركيزات على الأقل.

1) اليوم الأول: يتم وضع الخلايا غير المحولة في لوحة ثقافية مناسبة بكثافة خلوية تتراوح بين 20-25% ويتم زراعتها طوال الليل.

ملاحظة: يمكن زيادة كمية خلايا التطعيم للخلايا التي تتطلب كثافة أعلى لاكتشاف الحيوية.

2) اضبط تدرج التركيز ضمن النطاق المناسب وفقًا لنوع الخلية. يمكن للخلية الثديية ضبط 50، 100، 250، 500، 750، 1000 ميكرومتر1 جم/مل. قم بتخفيف محلول هيجروميسين ب بنسبة 1:10 باستخدام الماء منزوع الأيونات أو محلول PBS العازل إلى 5 مجم/مل. ثم قم بتخفيف المحلول إلى التركيز المناسب وفقًا للجدول التالي.

3) اليوم الثاني: استبدل الوسط المحضر حديثًا والذي يحتوي على التركيز المقابل للدواء. قم بعمل ثلاث عينات متوازية لكل تركيز.

4) ثم قم باستبدالها بوسط جديد يحتوي على الأدوية كل 3-4 أيام.

5) إجراء تعداد للخلايا الحية على فترات زمنية ثابتة (مثل كل يومين) لتحديد التركيز المناسب الذي يثبط نمو الخلايا غير المحولة. حدد أقل تركيز يمكنه قتل الغالبية العظمى من الخلايا في غضون العدد المثالي من الأيام (عادةً 7-10 أيام) باعتباره التركيز العامل لاختيار الخلايا المحولة بشكل مستقر.

3. فحص سلالات الخلايا الثديية المستقرة المحولة وراثيا

1) بعد 48 ساعة من التحويل الجيني، تمت زراعة الخلايا في وسط فحص يحتوي على هيجروميسين ب بتركيز مناسب (مباشر أو مخفف).

ملاحظة: تعمل المضادات الحيوية بشكل أفضل على الخلايا التي تنقسم بشكل نشط. إذا كانت الخلايا كثيفة للغاية، فلن يقتل المضاد الحيوي الخلايا. قم بتقسيم الخلايا بحيث لا تزيد نسبة التقاء الخلايا عن 25%.

2) قم بتغيير وسط الفحص كل 3-4 أيام.

3) قم بقياس تكوين مستعمرة الخلايا بعد 7 أيام من الفحص. قد يستغرق تكوين المستعمرة أسبوعًا آخر أو أكثر، اعتمادًا على نوع الخلية المضيفة، والتحويل الجيني، وفعالية الفحص.

4) اختيار 5-10 استنساخات مقاومة ونقلها إلى أطباق زراعة الخلايا مقاس 35 مم، وزراعتها باستخدام وسط فحص يحتوي على الدواء لمدة 7 أيام.

5) استبدالها بوسط جديد بدون أدوية للثقافة.

وثائق:

ورقة بيانات السلامة

60224_بيانات سلامة المواد_HB220420_AR.pdf

الدليل

60224_دليل_HB250115_AR.pdf