Diabetes mellitus (DM), en systemisk kronisk metabolisk sygdom karakteriseret ved kronisk forhøjet blodsukker forårsaget af en kombination af flere sygdomsfaktorer, er en global sundhedsepidemi og relateret til familiegenetik, miljøfaktorer, og autoimmunitet. Selvom DM, der er kendt i årtusinder, og der er opnået store fremskridt i dets diagnose og behandling, er der i øjeblikket ingen kur mod sygdommen, og dens folkesundhedsmæssige konsekvenser vokser kun. Derfor er det særligt vigtigt at etablere en passende dyremodel for DM og afklare patogenesen af DM og dets komplikationer. De almindeligt anvendte DM-dyremodeller er kirurgisk resektion af bugspytkirtlen, kemisk induceret diabetes, spontan diabetes dyremodel og transgene dyr osv.
I øjeblikket er diabetessygdomsmodellen induceret af Streptozotocin (STZ) er meget udbredt, velegnet til langtidsobservation. STZ er en nitrosoureaforbindelse, der, når den først er inde i kroppen, specifikt kan ødelægge pancreas-β-celler gennem følgende mekanismer:
(1) Injektion af højdosis STZ kan forårsage fald i koncentrationen af intracellulært coenzym I (NAD) i β-celler og dermed hæmme NAD-afhængig energi- og proteinmetabolisme, hvilket resulterer i celledød;
(2) STZ øger nitrogenoxid (NO) produktion, som har vist sig at deltage i β-celleskade;
(3) Indgivet i en lav dosis kan STZ udløse en autoimmun proces, der fører til ødelæggelse af β-cellerne i bugspytkirtlens øer: døde β-celler, på grund af en lav dosis STZ, kan fagocyteres af makrofager som antigener for at producere Th1-stimulerende faktor, hvilket gør lymfocytter af Th1-typen dominerende. Derefter producerer Th1-lymfocytter IL-2 og IFN-y, hvilket forårsager infiltration af inflammatoriske celler i øen og frigivelse af IL-1 og TNF-α, IFN-y, NO og H2O2 til at dræbe celler og til sidst inducere DM.
Yeasen Biotech giver høj succesrate STZ (kat#60256ES) til modellering: høj renhed ≥ 98% (HPLC).
1 Standard SOP for konstruktionen af den STZ-inducerede diabetesmodel
1.1 Forberedelse af dyr
Der er markant seksuel dimorfi, og mænd er mere modtagelige for at udvikle diabetes. Da østrogen interfererer med STZ-virkningen, er hundyr mindre følsomme over for diabetogen virkning af STZ end hannerne. Undersøgelser har vist, at kvinder har en dårlig modelleringsrate og en højere dødelighed end mænd, især type I.
Type I diabetes (T1DM): Rotter (170-200 g) og mus (17-22 g) anbefales. Efter en uges adaptiv fodring, hurtige dyr i 12 timer efterfulgt af intraperitoneal injektion af STZ, som let kan betjenes og med høj succesrate.
Type II diabetes (T2DM): Rotter (alder 4-5 uger, vægt 90-100 g, f.eks. SD eller Wistar) og mus (alder 4-5 uger, vægt 16-20 g, f.eks. C57, ICR eller Kunming) bør fodres med kost med højt fedtindhold og højt sukkerindhold i 4-6 uger forud for STZ-administration, og kropsvægten kan individuelt nås på ca.-0g. 30-35 g. SD anbefales til rotter og C57 til mus.
1.2 Dyrefodring før STZ administration
T1DM: Tillad alle mus eller rotter fri adgang til standard gnaverfoderdiæt og vand 1-2 ugers adaptiv fodring før STZ-behandling.
T2DM: Indtagelse af en diæt med højt fedtindhold og højt sukkerindhold for at gøre insulinresistent før STZ-behandling.
1.3 Reagensforberedelse
① Kost med højt fedtindhold og højt sukkerindhold
Diæten med højt fedtindhold og højt sukkerindhold fremstilles ved at blande basisrottefoder med saccharose, raffineret svinefedt og æggeblommepulver i et masseforhold: Andelene er 10% svinefedt, 20% saccharose, 10% æggeblommepulver, 0,5% natriumcholat og 59,5% basisfoder.
② STZ-natriumcitratbuffer
Fremstilling af opløsning A og opløsning B: Vej 2,1 g citronsyre (molekylvægt: 210,14) og opløs den i 100 ml dobbeltdestilleret vand til opløsning A; afvej 2,94 g natriumcitrat (MW: 294,10) og opløs det i 100 ml dobbeltdestilleret vand til opløsning B.
Fremstilling af natriumcitratbuffer: Bland opløsning A og B i et bestemt forhold (1:1,32 eller 1:1), juster pH til 4,2-4,5, og filtersteriliser ved hjælp af en 0,22 μm filtermembran. Dette giver den nødvendige natriumcitratbuffer; det anbefales at forberede og bruge det med det samme.
Vej det STZ-lyofiliserede pulver, anbring det i en tør, steril flaske, pak det ind med aluminiumsfolie og læg det på is. Tilsæt forafkølet natriumcitratbuffer (1 % w/v) for at opløse, og filtersteriliser ved hjælp af en 0,22 μm filtermembran.
【Bemærk】① Efter STZ-pulveret er taget ud af køleskabet, skal det opbevares ved stuetemperatur og væk fra lys i ca. 10 minutter, indtil det er helt optøet. ② Efter vejning skal flasken, der indeholder prøven af STZ, dækkes med aluminiumsfolie for at beskytte den mod lys, da STZ er ustabil. ③ Opløs ikke STZ på én gang, hvis du ikke er dygtig til injektion. Det anbefales at opløse STZ i grupper i henhold til operationsfærdigheden. Forbered STZ-opløsning til én gruppe ad gangen, såsom 10 eller 15 rotter/mus pr. gruppe.
1.4 STZ indsprøjtning
Indgive injektionen intraperitonealt eller via halevenen baseret på dyrets fastevægt. Sammenlignet med intraperitoneal injektion har haleveneinjektion en højere lægemiddeludnyttelseseffektivitet, men er mere teknisk udfordrende. Hvis injektionsteknikken ikke er dygtig, veksle mellem to grupper til injektionen, og injektionen skal afsluttes inden for 30 minutter.
T1DM: Til mus anbefales en enkelt høj dosis på 100-200 mg/kg, og en multiple lave doser på 20-50 mg/kg i fem på hinanden følgende dage; for rotter foreslås dosis at være 40-70 mg/kg, administreret i en enkelt injektion.
T2DM:Efter fodring med en diæt med højt sukkerindhold og højt fedtindhold i 1-2 måneder, til mus, anbefales en dosis på 70-120 mg/kg, administreret i en enkelt injektion; for rotter er den foreslåede dosis 25-40 mg/kg, administreret i en enkelt injektion.
【Bemærk】 Det anbefales at udføre præ-eksperiment for at bestemme den passende dosis af STZ på grund af forskellig vægt, lægemiddeltolerance, fastetid, injektionsmetode og fodringsproces for forsøgsdyr. Udfør ikke forsøget blindt direkte i henhold til doseringen i litteraturen.
1.5 Post-injektion
Efter injektionen af STZ, lad dyrene fri til vand og mad. Skift polstring hver dag. Hold buret rent og tørt. Undgå stærkt sollys. Desinficer så ofte som muligt.
【Bemærk】 Efter STZ-injektion vil dyrenes blodsukkerniveau vise tre faser: forbigående hyperglykæmi (1-2 timer), forbigående hypoglykæmi (6-10 timer) og kontinuerlig hyperglykæmi (>72 timer). Insulin og glukose skal tilføres korrekt.
1.6 Afhjælpning af dyremodellering
For modeller, der ikke opfylder kriterierne, kan STZ administreres yderligere, når dyret er stabiliseret (med en intraperitoneal injektion i en dosis på 10-20 mg/kg, valg af en passende dosis baseret på den faktiske situation), eller vent, indtil blodsukkerniveauet vender tilbage til det normale, og injicer derefter med den rutinemæssige dosis. Men for at opnå den ønskede effekt er det ofte nødvendigt at genstarte modelleringsprocessen efter at være vendt tilbage til en normal tilstand.
2 Evaluering af STZ inducerede DM dyremodeller
① Generelle karakteristika: tab af kropsvægt, polydypsi, polyfagi og polyuri.
② Fastende blodsukker (FGB), serum insulin niveau (FINS), oral glucosetolerance (OGT), fastende serum insulin (FSI) og insulinfølsomhed.
③ Serum biokemiske indekser: T-Cho, TG, HDL-C, LDL-C, CR, BUN, Alt osv.
④ Pancreas patologi: H&E-farvning.
3 Mulige årsager til svigt af STZ-induceret DM-model
① Dårlig kvalitet af STZ. Renheden af STZ til modellering må ikke være mindre end 98 % (HPLC-detektion).
② STZ-nedbrydning. STZ er let fugtig opløsning, bør opbevares tørt for at undgå fugt. Pulveret undgår lang stuetemperaturplacering, og den opløste STZ er meget ustabil, med en halveringstid for neutral pH på 15 min, og bør bruges på plads. Opløs venligst STZ med en sur pH-værdi, helst i et isbad.
③ STZ-opløsning blev injiceret i tarme eller andre organer.
Hvis modellen ikke opfylder DM-standarden, anbefales det at observere i yderligere 3 dage. Hvis det stadig mislykkes, gentages injektionsproceduren.
4 Årsagerne til høj dødelighed hos dyr induceret af STZ
① Dyr er undervægtige.
② Utilstrækkelig forsyning af drikkevand.
③ Hyperglykæmi eller hypoglykæmi, normalt hyperglykæmi. Dette kan afhjælpes ved insulininjektion eller midlertidigt glukosetilskud.
Insulintilskudsmetode: hvis for eksempel Novolin N eller NPH (neutral protamin zink insulin) gives for 2-3 enheder hver gang, vil den generelle dødelighed hos rotter være lavere efter 3-5 dage.
Glukosetilskudsmetode: Intraperitoneal injektion af 20 % glukose 4 timer efter STZ-injektion kan undgå rotters død på grund af lavt blodsukker forårsaget af faste.
④ Forsøgsdyr dræber hinanden på grund af mangel på mad og vandforsyning.
⑤ Infektion. DM-dyr er mere tilbøjelige til infektion end andre, især urinvejsinfektion og abdominal infektion på grund af polyuri. Det er nødvendigt at desinficere før og efter invasive operationer såsom intraperitoneal injektion, subkutan injektion og blodopsamling. For eksempel kan tetracyclin (eller aureomycin øjensalve) påføres såret efter blodsukkermåling hver gang for at forhindre infektion.
5 faktorer, der påvirker diabetesmodellering
Faktorer, der påvirker diabetessygdomsmodellen, omfatter kvaliteten af STZ-modelleringsreagenset, dyrenes tilstand og indgivelsesmetoden. De vigtigste egenskaber for reagenset omfatter renhed, stabilitet og opløselighed. Dyrenes tilstand omfatter hovedsageligt genetisk baggrund, køn, køn, vægt, avlsmiljø og koststruktur. Indgivelsesmåder indbefatter tidspunkt for administration, intervaller mellem doser og indgivelsesveje. Differentierede faktorer medfører differentierede modelleringseffekter.
6 Produkt ranbefaling
| Produktnavn | Kat# | Specifikation |
| 60256ES60 | 100 mg | |
| 60256ES76 | 500 mg | |
| 60256ES80 | 1 g | |
| Citronsyre, Monohydrat | 60347ES25 | 25 g |
| Citronsyre trinatriumsalt, Dihydrat | 60348ES25 | 25 g |
| Opløsningsmiddel til streptozocin STZ | 60750ES76 | 500 ml |
[1] Xi Z, et al. Dobbeltmodificerede nanopartikler overvinder sekventielle absorptionsbarrierer for oral insulinlevering. J Kontrolfrigivelse. 2022 feb;342:1-13. (PMID: 34864116, IF:7,727)