1.Baggrund for Laminin 521
Laminin 521 (LN521) er et nøglecelleadhæsionsprotein i den naturlige stamcelle-niche og en matrix til dyrkning og ekspansion af humane embryonale (hES) og inducerede pluripotente stamceller (hiPSC). LN521 binder til celleoverfladereceptorer og aktiverer cellesignalveje, hvilket resulterer i produktionen af mere funktionelle celler.
Laminin 521 reproducerer det biologisk relevante hPSC-miljø in vitro, fremmer tilknytningen, høj overlevelse og stærk langsigtet selvfornyelse af hPSC og er et nøglematrixprotein, der understøtter stamcellevækst og opretholder stabiliteten af basalmembranstruktur og ydeevne. Laminin 521 er også en af de mest almindeligt anvendte næringsstoffrie kulturmatricer. Derudover kan Laminin 521 opnå effektiv enkeltcellet passage af genetisk stabile og pluripotente stamceller uden tilsætning af nogen apoptoseinhibitorer. Cellerne vokser i et ensartet monolag uden behov for manuelt at fjerne eventuelle differentieringsområder. Derudover har undersøgelser vist, at LN521 kan understøtte PSC-vækst i mere end 10 generationer uden tegn på karyotype abnormiteter, og opretholder PSC's evne til at differentiere i de tre kimlag i de indre, mellemste og ydre kimlag.
Figur 1. Laminin 521 struktur [1]
2. Lamininbelægningseksperiment
2.1 Forbered laminin 521 til 400 µg/ml med sterilt deioniseret vand eller vand til injektion. Det anbefales at fortynde yderligere til 100 µg/ml med steril 1×DPBS (Ca++/Mg++) før brug og derefter fortyndes til en arbejdskoncentration på 5-10 µg/ml med steril DPBS (Ca++/Mg++). Belægningskoncentrationen varierer afhængigt af typen af dyrkede celler, og det anbefales at optimere den eksperimentelle protokol for at bestemme den optimale belægningskoncentration for cellerne. Se tabel 1 for anbefalede koncentrationer.
Note: DPBS indeholdende Ca2+ og Mg2+ bør anvendes, da divalente kationer er vigtige for proteinstruktur og funktion. Den nødvendige arbejdskoncentration af Laminin 521 afhænger af cellerne og anvendelsen. Vi anbefaler en initial belægningskoncentration på 0,5 μg/cm2.
Tabel 1. Anbefalede mængder af rekombinant human laminin arbejdsopløsning til forskellige dyrkningskar.
| Petriskål | Belægningskoncentration (μg/mL) | Tillægsbeløb på LN521 | Tillægsbeløb på 1*DPBS | Samlet volumen |
| 6 godt | 5 | 50 μL/brønd | 950 μL/brønd | 1 ml/brønd |
| 12 godt | 5 | 25 μL/brønd | 475 μL/brønd | 0,5 ml/brønd |
| 24 godt | 5 | 15 μL/brønd | 285 μL/brønd | 0,3 ml/brønd |
| 48 godt | 5 | 7,5 μL/brønd | 142,5 μL/brønd | 150 μL/brønd |
| 96 godt | 5 | 3,5 μL/brønd | 66.5 μL/brønd | 70 μL/brønd |
| 35 mm petriskål | 5 | 50 μL/brønd | 950 μL/brønd | 1 ml/brønd |
| 60 mm petriskål | 5 | 100 μL/brønd | 1900 μL/brønd | 2 ml/brønd |
| 100 mm petriskål | 5 | 300 μL/brønd | 5700 μL/brønd | 6 ml/brønd |
Ovenstående volumen er baseret på en belægningskoncentration på 5μg/mL.
2.2 Tilsæt den specificerede mængde laminin-DPBS-blanding til hver brønd og ryst forsigtigt. Sørg for, at hele overfladen er dækket med lamininbelægningsopløsning, da ubelagte overflader ikke understøtter cellevækst.
2.3. Placer pladen i en 37°C inkubator og inkuber natten over. Den mindste inkubationstid er 2 timer, men inkubation natten over anbefales for at opnå ideelle cellekulturbetingelser. Pas på ikke at lade kulturbeholderen tørre ud, hvilket vil inaktivere LN521.
2.4. Når cellerne er klar til at blive podet, aspirer du laminin 521-opløsningen.
3.iPSC-kultur
3.1 iPSC optøning (med 12-brønds plade som et eksempel)
3.1.1 Fjern iPSC'er fra flydende nitrogen eller tøris og optø i 37°C vand i 10 sekunder.
3.1.2 Steriliser kryobalerne med 75 % alkohol og overfør dem til en arbejdsflade.
3.1.3 Overfør cellerne til et nyt 15 mL centrifugerør indeholdende 9 mL DMEM-F12.
3.1.4 Centrifuger 15 mL centrifugerøret ved 300 g i 5 minutter ved stuetemperatur.
3.1.5 Kassér lamininopløsningen fra den coatede 12-brønds plade.
3.1.6 Kassér cellesupernatanten og resuspender forsigtigt iPSC'erne i 1 mL mTeSR-plus (indeholdende 10 µM Y-27632) og overfør dem til den coatede 12-brønds plade. Ryst pladen for at fordele cellerne jævnt til en endelig celletæthed på 1×10^5 celler/brønd og lad stå ved stuetemperatur i 10 minutter. Sørg for, at kulturen passeres inden for 4-5 dage.
3.1.7 Sæt 12-brøndspladen tilbage i 37°C inkubatoren til inkubation.
3.1.8 Dyrkningsmediet, der indeholder ROCK-inhibitor, skal fjernes efter 12-16 timer og fortsætte med at blive dyrket i mediet uden inhibitor.
Tabel 2. Cellepodningstæthed i forskellige dyrkningskar, celleantal bestemt i henhold til cellevæksthastighed
| Cellekulturkar | 6 godt | 12 godt | 24 godt | 96 godt |
| Cellenummer | 2,5~3,5×105 | 6~8×104 | 3~4×104 | 0,5~1×104 |
3.2. iPSC Passaging Protocol
3.2.1 Kassér kultursupernatanten og skyl med 1 mL PBS (Ca‑‑/Mg‑‑).
Note: Brug PBS uden Ca2+ og Mg2+, da divalente kationer har en negativ effekt på nogle dissociationsenzymer.
3.2.2 Kassér PBS'en og tilsæt 0,5 mL Gentle Cell Dissociation Reagent.Inkuber ved stuetemperatur i 6-8 minutter eller observer under et mikroskop, indtil cellerne ikke længere er bundet til pladen.
3.2.3 Tilsæt en tilsvarende mængde DMEM-F12, bland forsigtigt cellerne, overfør til et centrifugerør ved stuetemperatur og centrifuger ved 300 g i 5 minutter.
3.2.4 Før du passerer celler, forberedes en lamininbelagt 12-brønds plade.
3.2.5 Kassér supernatanten og resuspender cellerne i mTeSR-plus-medium indeholdende 10 µM Y-27632.
3.2.6 Overfør cellerne til den forberedte laminin-coatede 12-brønds plade. Ryst forsigtigt pladen for at fordele cellerne jævnt og lad dem stå ved stuetemperatur i 10 til 20 minutter.
3.2.7 Placer 12-brøndspladen i en 37°C inkubator og inkuber.
Note: iPSC'er vil hurtigt differentiere og dø efter at være vokset til et monolag. For at opretholde vækst og pluripotens skal de passeres, før de er sammenflydende.
3.3. Kryokonservering af iPSC
3.3.1 Forbered det blide celledissociationsreagens.
3.3.2 Udfør celleadskillelse i henhold til iPSC-passageprotokollen, brug celleorganeltællingen for at sikre celletætheden før kryokonservering.
3.3.3 Hvert rør med celler skal fryses ved en celletæthed på 1-2×10^6. Følg trinnene for centrifugering og fjernelse af cellekulturmedium i iPSC-passageprotokollen. Resuspender den isolerede iPSC-pellet i en passende mængde kryokonserveringsopløsning
3.3.4 Tilsæt 1 mL resuspenderet cellekryokonserveringspellet til et 1,5 mL kryokonserveringsrør, udfør programafkøling og overfør derefter til flydende nitrogen til langtidsopbevaring.
4.Vigtige bemærkninger om lamininbelægning
4.1. Alle trin i den eksperimentelle protokol skal udføres under sterile forhold.
4.2. Undgå at udsætte laminin for stuetemperatur i længere tid.
4.3. Undgå gentagen frysning og optøning
4.4. Efter optøning kan den ufortyndede proteinstamopløsning opbevares ved 2~8 ℃ under sterile forhold og kan opbevares stabilt i mindst 3 måneder.
5.Relateret produktinformation
| Produktnavn | Kat# | Størrelse |
| 92602ES | 10μg/100μg/500μg/1mg |
6.Referencer
[1]Pulido D, Briggs DC, Hua J, Hohenester E. Krystallografisk analyse af laminin β2-kortarmen afslører, hvordan LF-domænet indsættes i et regulært array af LE-domæner. Matrix Biol. 2017 Jan;57-58:204-212.