Når det kommer til telomerer og Protelomerase i biologi tænker folks sind ofte først på aldring, et uundgåeligt naturligt fænomen. Telomerer er gentagne DNA-sekvenser i enderne af eukaryote kromosomer, som bærer ansvaret for at opretholde kromosomintegriteten og regulere celledelingscyklussen.
Protelomerase er et revers transkriptase DNA-syntese-enzym, der forlænger telomerer. Det er et nukleoprotein sammensat af RNA og proteiner. Proteinkomponenten kan katalysere syntesen af telomer-gentagelsessekvenser med RNA-komponenten.
Figur 1. Mekanisme for Protelomerase-medieret telomerudvidelse[1]
Protelomerase kan reparere og forlænge telomerer, kompensere for defekter i DNA-replikation, forhindre telomertab under celledeling og øge antallet af celledelinger. I 2009 blev Nobelprisen i fysiologi eller medicin tildelt Elizabeth H Blackburn, Carol W Greider og Jack W Szostak for deres fremragende bidrag til at afsløre telomerers og protelomerases afgørende rolle. i cellulær funktion og aldring.
I dag vil jeg præsentere dig for en unik Protelomerase: TelN proProtelomerase. TelN Protelomerase kommer fra bakteriofag N15 og er en komponent i N15-replikationssystemet, der deltager i dannelsen af lineært profag-DNA. I modsætning til Protelomerase i eukaryoter er TelN et rent proteinenzym uden nogen RNA-komponenter. Det har spaltning-ligation aktivitet og efterlader en kovalent lukket ende ved spaltningsstedet efter skæring af dobbeltstrenget DNA (dsDNA).
Figur 2. TelN Protelomerase Spaltningssted
TelN Protelomerase Handlingsmekanisme
Genkendelsesstedet for TelN Protelomerase er en palindromsekvens, der er 56 bp lang, med telR og telL på begge sider. Den centrale position af målsekvensen er også en palindromsekvens telO. TelN Protelomerase spalter inden for telO-sekvensen og danner en kovalent lukket hårnålestruktur ved de to spaltningsender. Enden af DNA'et efter fordøjelse er stadig sammensat af telR og telL, som er kendt som doggybone DNA (dbDNA).
Figur 3. Protelomerase spaltningsmekanisme på TelN-stedet[2]
På grund af TelN Protelomerases specielle enzymspaltnings-ligeringsaktivitet kan cirkulært plasmid-DNA omdannes til lineære kovalent lukkede håndvægtformede molekyler gennem en en-trins enzymatisk reaktion. Sammenlignet med lineære åbne DNA-molekyler har lineært lukket DNA højere proteinekspressionsniveau i celler, hvilket er meget velegnet til at konstruere lineær lukket ende mini-DNA med høj stabilitet og minimal fremmed sekvens. Plasmid-DNA spiller en afgørende rolle som kerneelementet i mRNA-vaccine, DNA-vaccine og cellegenterapi. Den traditionelle plasmidproduktionsmetode involverer fermentering med E. coli og multi-stage amplifikation, og den ukontrollerbare risiko i fermenteringsprocessen begrænser udbyttet af højkvalitets plasmid, som bliver nøglen til at begrænse produktionskapaciteten af vacciner. Touchlight-virksomheden i Storbritannien har lanceret en innovativ dbDNA-teknologi. Denne teknologi forstyrrer den traditionelle metode til bakteriel fermentering til fremstilling af plasmid DNA og i stedet for at bruge in vitro enzymatisk syntese af DNA. Den specielle enzymspaltnings-ligeringsaktivitet af TelN Protelomerase anvendes også til at generere lineært lukket mini-DNA i ovenstående metode.
Anvendelse af TelN Protelomerase i DNA-enzymatisk syntese
DNA in vitro enzymatisk metode baseret på phi29 DNA polymerase og TelN Protelomerase kan undgå mange ukontrollerbare risici i den biologiske fermenteringsproces, og den in vitro enzymatiske metode kan syntetisere DNA med hurtig hastighed og højt udbytte. Det syntetiserede DNA kan bruges i mange nye teknologier, såsom mRNA-vaccine, DNA-vaccine, genterapivektor og genredigering.
Figur 4. Flowchart over DNA enzymatisk syntese[3]
Enzymatisk DNA-synteseproces
- Skabelon denaturering
Den cirkulære plasmid-DNA-skabelon omdannes til to enkeltstrengede cirkulære DNA'er ved en denatureringsproces.
- Rullende cirkelforstærkning
Rullecirkelamplifikation blev udført ved at anvende Phi29 DNA-polymerase og enkeltstrenget cirkulært DNA til at generere langt lineært dobbeltstrenget concatemerisk DNA med Protelomerase-genkendelsessekvensintervaller.
- Skæring og kovalent lukning
TelN Protelomerase genkender telRL på DNA'et af telomere komplekser og udfører spaltningsligeringsaktiviteter for at generere lineære, kovalent forbundne DNA-monomerer.
- Fjernelse af bakteriel rygrad DNA
Restriktionsendonukleaser eller exonukleaser nedbryder bakteriens skelet-DNA med en åben struktur i enden for at opnå DNA, der kun indeholder målgenekspressionselementerne. Enzymatisk syntese af DNA-teknologi omgår biologisk fermentering og kan hurtigt opnå GMP-niveau plasmid DNA-syntese, hvilket løser produktionskapacitetsbegrænsningerne inden for genterapi og mRNA-vacciner. Det rummer et enormt potentiale for industrialisering. For at fremme udviklingen af DNA-enzymatisk synteseteknologi kan YEASEN Biology levere kerneenzymmaterialer til DNA-enzymatisk syntese, såsom phi29 DNA-polymerase (14404ES) og TelN Protelomerase (14540ES), for at hjælpe med forskning og produktion af DNA-enzymatisk synteseteknologi.
Ppræstationspræsentation af YEASEN's TelN Protelomerase
- Cleavage-ligation-ydeevnen er fremragende, hvilket svarer til importerede mærker.
Ved anvendelse af et supersnoet plasmid indeholdende TelN Protelomerase-genkendelsesstedet som skabelon blev gradientadditionsenzymet (0,078-5 U) fra YEASEN og mærket A tilsat. 0,5 μg supercoiled plasmid blev omdannet til lukket lineært dobbeltstrenget DNA (dsDNA). Gelelektroforese blev brugt til at detektere konverteringseffektiviteten, og resultaterne viste, at spaltnings- og ligeringsaktiviteten af YEASEN's TelN Protelomerase var ækvivalent med den for Brand A.
Figur 5. Protelomerasespaltningsaktivitet detektion af TelN M:Marker, C: supercoiled plasmidkontrol
- Lukkeintegriteten af lineært dsDNA > 90 %
Brug af det supercoilede plasmid indeholdende TelN Protelomerase-genkendelsessted som skabelon, tilføjelse af TelN Protelomerase af YEASEN og mærke A, konvertering af 0,5 μg supercoiled plasmid til lukket lineært dsDNA og tilføjelse af T5 exonuklease for at påvise dens slutintegritet gennem båndnedbrydningsgrad. Resultaterne viste, at dsDNA-endelukningsintegriteten genereret af TleN Protelomerase fra YEASEN var > 90 %, hvilket svarede til den for mærke A.
Figur 6. TelN Protelomerase-endelukningsintegritetstest. Cl: plasmid indeholdende TelN-genkendelsessted uden TelN Protelomerase; C2: plasmid indeholdende TelN-genkendelsessted, TelN Protelomerase, uden T5-exonuklease; Plasmid: plasmid indeholdende TelN-genkendelsessted.
Relaterede produkter af DNA enzymatisk syntese
| Produktklassificering | Produktnavn | Katalog nr. |
| Protelomerase | 14540ES | |
| Phi29 DNA-polymerase | 14404ES | |
| Exonuklease | Exonuklease III | 14525ES |
| 14538ES | ||
| dNTP | 10125ES |
Referencer
[1] Giardini MA, Segatto M, da Silva MS, Nunes VS, Cano MI. Telomer og Protelomerase biologi. Prog Mol Biol Transl Sci. 2014;125:1-40.
[2] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. Lineær lukket mini-DNA genereret af det prokaryote spaltnings-sammenføjningsenzym TelN er funktionelt i pattedyrsceller. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654.
[3] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. Lineær lukket mini-DNA genereret af det prokaryote spaltnings-sammenføjningsenzym TelN er funktionelt i pattedyrsceller. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654. doi:10.1007/s00109-002-0362-2.