Med den hurtige udvikling af glycoproteomics og antistoflægemiddelforskning har glycosyleringsmodifikation også tiltrukket sig stor opmærksomhed. Kontakten mellem celler og celler og mellem celler og patogener fuldendes hovedsageligt gennem interaktionen mellem sukkerarter og proteiner, og glycosylering bestemmer glykokonjugaternes adhæsionsegenskaber. I IgG er den konserverede N-bundne glycosylering ved Asn297 i Fc-regionen også afgørende for dens aktivitet. Derudover har nogle antistoffer også yderligere N-glycaner, som sammen med det konserverede sted ved Asn297 i Fc-regionen påvirker antistoffets genkendelse, halveringstid og immunrespons.
Proteinglykosylering er en kompleks post-translationel modifikation, der involverer forbindelsen af glycankæder på specifikke steder på proteiner. Afhængigt af typen af glycankæde opdeles glycoproteiner i N-bundne glycoproteiner, O-bundne glycoproteiner osv.; desuden påvirkes proteinglykosylering også af værtscelletypen og fermenteringsbetingelser (såsom dyrkningsmedium, pH-værdi, temperatur osv.). Derfor har glycoproteiner normalt heterogenitet i glycosyleringsmønstre, herunder glycosyleringssteder, glycosyleringsniveauer og den specifikke struktur af glycankæder, hvilket gør glycankædeanalyse og strukturel karakteriseringsarbejde ekstremt udfordrende. For at opnå den maksimale mængde af glycankædestrukturel information er hovedstrategien for glycankædeanalyse først at frigive glycankæderne fra proteinerne og derefter udføre detaljeret analyse og karakterisering. I denne strategi er en effektiv, nøjagtig og stabil deglycosyleringsmetode afgørende.
Enzymatiske metoder er for tiden meget brugt til deglycosylering.
Glycoproteiner kan klassificeres i N-bundne og O-bundne glycopeptider baseret på deres typer af glycankæder. For N-bundne glycopeptider omfatter almindeligt anvendte enzymer peptid N-glycosidase F (PNGase F), endoglycosidase H (Endo H) og endoglycosidase S (Endo S). PNGase F hydrolyserer GlcNAc-Asn-bindingen og kan fjerne høj mannose-, kompleks- og hybridglycankæder. Endo H spalter glykosidbindinger i N-glycankædens pentasaccharidkerne. Endo S spalter specifikt N-bundne glycaner fra chitobiose-kernen af den tunge kæde af naturligt IgG.
Figur 1. Skærested for PNGase F, Endo H og Endo S.
Blandt dem, PNGase F er den mest effektive enzymatiske metode til at fjerne næsten alt N-bundet oligosaccharider i glycoproteiner, som kan spalte højmannose-, hybrid- og komplekse oligosaccharid-glycoproteiner forbundet med asparagin, hvilket specifikt fjerner N-bundne glycaner. Spaltningsstedet er: amidbindingen mellem den inderste N-acetylglucosamin (GlcNAc) og asparaginresten, mens asparaginen omdannes på proteinet efter enzymatisk hydrolyse til asparaginsyre.
Når α1-6 fucose er placeret ved GlcNAc-kernen, kan PNGase F også skære; kun når α1-3 fucose er lokaliseret ved GlcNAc-kernen (almindelig i plante- og insektglykoproteiner), kan PNGase F ikke skære.
Imidlertid kræver den konventionelle PNGase F enzymatiske reaktion adskillige timer at frigive antistof N-glycaner, og på grund af præferencen for glycanfrigivelse kan ufuldstændig deglycosylering føre til skæve resultater, og den opnåede glycanfordeling repræsenterer muligvis ikke den korrekte sammensætning af terapeutiske antistoffer. Derfor er opnåelse af en nøjagtig N-glycanprofil så hurtigt som muligt afgørende for glykosyleringsovervågning under produktionsprocessen af antistoffer og antistoffusionsproteiner og andre bioterapeutiske midler.
Hurtig PNGase F
Fast PNGase F er et optimeret rekombinant reagens, der hurtigt og fuldstændigt kan deglycosylere antistoffer, immunglobuliner, fusionsproteiner og andre glykoproteiner på få minutter. Dette enzym kan hurtigt og uden præference fjerne alle N-glycaner og kan direkte anvendes til nedstrøms kromatografi eller massespektrometrianalyse. Yeasen Fast PNGase F, N-glycosidase F (hurtig version) forenkler den eksperimentelle proces og reducerer eksperimentel tid, samtidig med at følsomhed og repeterbarhed sikres.
Produktegenskaber:
Hurtig: Fuldstændig og hurtig deglykosylering på få minutter.
Høj renhed: Ingen protease, glycosidasekontamination, renhed ≥95%.
Ikke-selektiv: Fjern hurtigt og uden præference alle N-glycaner.
God kompatibilitet: Anvendes direkte til nedstrøms kromatografi eller massespektrometrianalyse.
Testdata:
Et-trins proteindeglykosylering:
- 10 µg substrat/100 µg antistof og ddH2O blandet til et samlet volumen på 16 µl;
- Tilsæt 4 μL Fast PNGase F-buffer (5x), slutvolumen 20 ul;
- Tilsæt 1 μL Fast PNGase F.
- Inkuber ved 50°C i 10 minutter.
Figur 2. En-trins enzymatisk spaltningseffekt på proteinsubstrat (A) og antistof (B).
1: Protein MarkerCat#20350ES) 2: Konkurrent + substrat eller antistof 3: Konkurrent + substrat eller antistof 4: Yeasen Fast PNGase F 5: Yeasen Fast PNGase F6: Substrat eller antistof 7: Yeasen Fast PNGase F 8: Konkurrent
To-trins proteindeglycosylering:
- 10 µg substrat/100 µg antistof og ddH2O blandet til et samlet volumen på 16 µl;
- Tilsæt 4 μL Fast PNGase F-buffer (5x), slutvolumen 20 ul;
- Inkuber ved 80°C i 2 minutter, afkøl til stuetemperatur.
- Tilsæt 1 μL Fast PNGase F.
- Inkuber ved 50°C i 10 minutter.
Figur 3. To-trins enzymatisk spaltningseffekt på proteinsubstrat (A) og antistof (B).
1: Protein MarkerCat#20350ES) 2: Konkurrent + substrat eller antistof 3: Konkurrent + substrat eller antistof 4: Yeasen Fast PNGase F 5: Yeasen Fast PNGase F6: Substrat eller antistof 7: Yeasen Fast PNGase F 8: Konkurrent
Konklusion:
- Yeasen Fast PNGase F har samme eller højere enzymatiske spaltningseffektivitet som importerede konkurrenter under de samme reaktionsbetingelser;
- Det anbefales at udføre en to-trins enzymatisk spaltning for at sikre højere enzymatisk spaltningseffektivitet. Nogle antistoffer (såsom Fab N-glykosylering) kræver et forvarmningstrin
for effektiv deglykosylering.
Desuden Yeasen giver også almindelig PNGase F(Cat#20407ES, specifik aktivitet: 100.000 U/mL) og andre typer glycosidaser, såsom Endo H glycosidase H (Cat#20414ES), Endo S glycosidase S (Cat#20413ES).
Købsvejledning
| Produktumber | 20406ES | 20407ES | 20414ES | 20413ES |
| Produktnavn | Hurtig PNGase F | PNGase F | Endo H | Endo S |
| Kilde | Gær rekombinant ekspression | Gær rekombinant ekspression | Gær rekombinant ekspression | E. coli rekombinant udtryk |
| Specifik aktivitet | Ikke relevant | 100.000 U/ml | 1000000U/ml | 8000 U/mg |
| Spaltningssted | Næsten alle N-forbundne glycaner | Næsten alle N-forbundne glycaner | N-bundne høj mannose glycaner | Spalter inden for kernedisaccharidstrukturen af IgG tung kæde |
| Fordøjelsestid | 10 min | 1-3 timer | 1-3 timer | 1 t |
| Glykosylering | Egnet | Egnet | Egnet | Egnet |
| Protein struktur | Egnet | Egnet | Egnet | Egnet |
bestilling af information
| Produktnavn | Produktnummer | Specifikation |
| 20406ES20/50 | 20 T/50 T | |
| 20407ES01/02 | 15000 U /75000 U | |
| 20414ES92/97 | 10000 U /50000 U | |
| 20413ES80/90 | 1000 U/5 x 1000 U |