Efterhånden som medicinsk forskning fortsætter med at udvikle sig, er målrettet terapi blevet mere moden. Udgangspunktet for målrettet behandling er at udføre genetiske tests på de molekylære mål for medicin for at identificere genmutationer, der forårsager arvelige lidelser eller maligniteter. ARMS-PCR er en ny metode baseret på PCR, der kan detektere adskillige DNA-punktmutationer. I øjeblikket er det en af ​​de mest essentielle og udbredte metoder til skræddersyet genetisk identifikation af kræftformer. Fordelene ved dets terapeutiske brug er blevet anerkendt af felteksperter.

1. Hvordan virker allel-specifik PCR?
2. Hvordan forbedrer man ARMS specificitet?
3. Hvad er egenskaberne ved produkter leveret af Yeasen?
4. Hvad er data om produktets ydeevne?
5. Hvordan bestiller folk produkter?

1. Hvordan virker allel-specifik PCR?

ARMS-PCR er Amplification Refractory Mutation System PCR (ARMS-PCR), også kendt som Allele-Specific PCR (AS-PCR). Den allelspecifikke forlængelse reguleres til at identificere vildtype-allelen og mutant-vildtypegenet, og fluorescenssignalværdien måles ved hjælp af Taqman-probeteknikken.
ARMS PCR-primere er designet med forskellige nukleotider i 3'-enden af ​​allelens to opstrømsprimere, og de to primere er henholdsvis specifikke for vildtypen og mutanttypen. Under amplifikation er opstrømsprimere, der ikke matcher skabelonen fuldstændigt, ude af stand til at danne komplementære basepar, hvilket resulterer i mismatches, hindret forlængelse og manglende evne til at generere PCR-produkter, hvorimod primersystemer, der matcher templaten, kan amplificere de tilsvarende PCR-produkter. Fluoroforen på Taqman-proben kan udsende et fluorescerende signal, der kan detekteres af enheden, og genotypen kan valideres ved at evaluere fluorescensdataene.
ARMS-teknologien har høj følsomhed, detektionsgrænsen kan nå 100 kopier/ml, og detektionsgrænsen for tumorvæv kan nå en mutationsrate på 0,5%. Derudover er ARMS tidskrævende og lavpris, og resultaterne er intuitive og nemme at bedømme. Dette skyldes, at ARMS kombineret med qPCR eller elektroforeseteknologi kun kræver én PCR-reaktion, hvilket tager kortere tid. Kun upstream-primere skal optimeres til ARMS-teknologi, som har lavere omkostninger og intuitive resultater sammenlignet med real-time PCR-teknologi, der bruger MGB-prober. Da det meste af DNA'et ekstraheret fra paraffinindlejrede vævsprøver er fragmenteret, kan nøjagtige detektionsresultater ikke opnås. ARMS-metoden er designet til at minimere længden af ​​målproduktet og derved adressere denne vanskelighed i paraffinindlejret væv. Samtidig realiserer ARMS kombineret med PCR-platformen lukket rør-drift, som er enkel at betjene og ikke kræver produktefterbehandling, hvorved kontaminering af amplifikationsprodukter undgås i størst muligt omfang.
Teoretisk set skal Taq DNA-polymerase være fuldstændig komplementær til den resterende template i 3'-enden af ​​primeren for at udføre effektiv polymerisation. Imidlertid påvirkes stringensen af ​​Taq DNA af flere faktorer. I nogle tilfælde kan en forlængelse fortsætte, selvom den 3'-terminale base af primeren ikke er komplementær til templaten. Hvis der kun er én basemismatch ved 3'-enden, kan primerne mismatches og forlænges, men forlængelseseffektiviteten er lav. Forskellige 3'-endedislokationer har forskellige forlængelseseffektiviteter. Hvis andre mismatchede baser introduceres i 3'-enden, er antallet af mismatches for stort, og 3'-enden kan ikke forlænges efter et vist niveau.Derfor kan kun én basemismatch ved 3'-enden af ​​primeren ikke skelne tilstrækkeligt mellem de to alleler, hvilket resulterer i falske positive resultater.

2. Hvordan forbedrer man ARMS specificitet?

Fokus for forbedring af ARMS-specificitet er at forbedre primerforlængelsespecificitet. En mismatchet base kan indføres ved 2. eller 3. base fra 3'-enden. De mismatchede baser virker sammen med de mismatchede baser ved 3'-enden, og i templaten, der ikke er komplementær til 3'-enden, reduceres primeramplifikationsprodukthastigheden. Mens primere amplificerer normalt i templates, der er komplementære til deres 3'-ender, afhænger typen af ​​mismatchede baser af primere af typen af ​​basemismatch ved 3'-enden.
Efter at de specifikke primere til ARMS er designet, kræves et par TaqMan-prober til allelspecifik fluorescensresonansenergioverførsel. TaqMan-prober har to fluorescerende farvestoffer, 5'-enden er et fluorescerende gen, og 3'-enden har et generelt fluorescens-quenching-gen. I en komplet probe er quencher-genet og det fluorogene gen rumligt meget tæt på hinanden, hvilket resulterer i fluorescens-quenching. Under normale omstændigheder kan fluorescensen udsendt af fluoroforen i 5'-enden ikke detekteres, og kun baggrundsfluorescensen af ​​quencheren i 3'-enden kan detekteres. I processen med målgenamplifikation vil både PCR-primere og fluorescensmærkede prober være komplementære til målsekvensen under de-OR. Når Taq-enzymet støder på en probe, der er stabilt bundet til templaten, når template-strengen forlænges, vil 5'-3'-exonukleasen af ​​Taq-enzymet nedbryde den specifikke probe bundet til templaten. Fluoroforen på proben adskilles af fysisk rum, quenching-effekten forsvinder, og fluorescens udsendes. Mismatch mellem svagt fluorescerende prober og målsekvenser vil reducere mængden af ​​frigivet fluorescens.

Figur 1 Grundlæggende koncept for ARMS-PCR

3. Hvad er egenskaberne ved produkter leveret af Yeasen?

YEASEN Hieff Unicon™ Multiplex ARMS qPCR Mix er et kit baseret på amplifikationsblokkonceptet, der muliggør effektiv ARMS-PCR-medieret genotypebestemmelse.

👍Høj selektivitet: i stand til at identificere flere genmutationer;
👍Høj følsomhed: mutante primere kan detektere mutationer ved koncentrationer så lave som 0,5 % i 10 ng/L DNA;
👍Enkel at læse: Resultaterne er indlysende og objektivt vurderet, og det er ligetil og ukompliceret;
👍Enkel at betjene: Den er kompatibel med en række PCR-udstyr, driftstilstanden er standardiseret, og den indbyggede detektering kan udføres på 90 minutter.

4. Hvad er data om produktets ydeevne?

4.1 Overlegen produktblokeringspåvirkning

Eksperiment: 5L skabeloninput, 10ng/L vildtypeskabelon og ækvivalente mængder mutantplasmid blev amplificeret ved anvendelse af mutante primere
Websted: KRASG13D (38G>A)
Rød：13755；Blå: Konkurrenter

Figur 2 viser, at vildtype-primere amplificerer både vildtype- og mutant-templates. Ifølge amplifikationskurven har vildtype-skabelonen ingen top, eller forskellen i Ct-værdi mellem vildtypen og mutanten er 6-8, hvilket gør det muligt effektivt at skelne mellem vildtype- og mutantgenerne.

4.2 Produktdetektionshastigheden kan nå op på 0,05 %

Eksperiment 1: Selvblande standardpræparationsteknik (50%): 50μL 10ng/μL vildtype-DNA og 50μL 3X103 kopier af mutantplasmid.
Websted: KRASG13D(38G>A)

Figur 3. I henhold til amplifikationskurven fortsætter produktet med at fungere effektivt ved en koncentration på 0,05 %

Eksperiment 2: Den købte 5 % standard (50 ng/μL) blev fortyndet med biblioteksfortynder til 10 ng/μL og derefter yderligere fortyndet med 10 ng/μL 293 g DNA til 0,1 % og 0,05 %.
Websted: L858R
Rød：13755；Blå: Konkurrenter

Figur 4: Ifølge amplifikationskurven kan detektionshastigheden af ​​loci mod en vildtype-gDNA-baggrund på 10ng/μL være så høj som 0,05 %, og efterfølgende validering ved kommercielle standarder viser, at vores produkter har en fremragende detektionshastighed.

4.3 Fremragende produktstabilitet

Produktets forstærknings- og blokeringseffekt er upåvirket af 10 cyklusser med frysning og optøning.
Eksperiment: rød: -20 ℃; grøn: ægte fryse-tø 5 gange; blå: ægte fryse-tø 8 gange; lilla: ægte fryse-tø 10 gange.
Websted: L858R

Figur 5 viser, at gentagen frysning og optøning af reagens 13755 ti gange ikke har nogen indflydelse på dets amplifikations- og blokeringsegenskaber.

Dets amplifikations- og blokeringseffekt er upåvirket af 37 °C i 7 dage.
Eksperiment: Rød: -20°C; Grøn og lilla: 37°C i 7 dage.
Websted: L858R

Figur 6 viser, at syv dage ved 37°C ikke har nogen indflydelse på amplifikations- og blokeringsvirkningen af ​​13755-reagens.

5. Hvordan bestiller folk produkter?

Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., grundlagt i 2014, er en højteknologisk virksomhed, der beskæftiger sig med forskning og udvikling og produktion af værktøjsenzymråmaterialer og antigenantistoffer. Dets produkter omfatter molekylære diagnostiske enzymer, proteiner og antistoffer, der bruges i lægemidler, fødevaresikkerhedstest, avl, retfærdighed og andre industrier. Vi er forpligtet til at give kunder inden for biovidenskab produkter og tjenester af høj kvalitet. De produkter, som Yeasen kan levere, er som følger:

Tabel 1: Produkter leveret af Yeasen