Ct-værdi er en afgørende resultatrepræsentation i fluorescerende kvantitativ PCR. Det bruges til at beregne forskelle i genekspressionsniveauer eller genkopietal. Så hvilket interval af Ct-værdier kan anses for rimeligt i fluorescerende kvantificering? Hvordan kan vi sikre, at Ct-værdierne falder inden for et effektivt interval? Lad os i dag tillade Xiao Yi at besvare dette spørgsmål for alle.
Hvad er Ct værdi?
I qPCR-amplifikationsprocessen refererer Ct-værdien til antallet af amplifikationscyklusser (Cycle Threshold), hvor fluorescenssignalet fra det amplificerede produkt når den indstillede fluorescenstærskel. "C" står for Cycle, og "T" står for Threshold. Enkelt sagt er Ct-værdien antallet af cyklusser, det tager for startskabelonen i qPCR at nå en vis mængde produkt, hvilket vil blive yderligere forklaret senere.
Hvad er funktionen af Ct-værdien?
1. Forholdet mellem eksponentiel amplifikation, skabelonmængde og Ct-værdi
I et ideelt scenarie, under qPCR, amplificeres gener eksponentielt og akkumuleres over et vist antal cyklusser. Forholdet mellem antallet af amplifikationscyklusser og mængden af produkt kan udtrykkes som: mængden af amplificeret produkt = initial skabelonmængde ×(1 + En)^antal cyklusser. Imidlertid forekommer qPCR-reaktioner ikke altid under ideelle forhold. Når mængden af amplificeret produkt når en "vis produktmængde", er antallet af cyklusser på dette tidspunkt Ct-værdien, hvilket indikerer perioden med eksponentiel amplifikation. Forholdet mellem Ct-værdien og den oprindelige skabelonmængde er som følger: Der er et lineært forhold mellem Ct-værdien af en skabelon og logaritmen af det oprindelige kopinummer af den skabelon. En højere koncentration af initial template resulterer i en lavere Ct-værdi, hvorimod en lavere koncentration af initial template fører til en højere Ct-værdi.
2. Amplifikationskurve, fluorescenstærskel og en bestemt produktmængde
Mængden af qPCR-amplifikationsprodukter er direkte repræsenteret i form af fluorescenssignaler, som er kendt som amplifikationskurven. I de tidlige stadier af PCR, når amplifikation er under ideelle forhold, og antallet af cyklusser er lavt, er akkumuleringen af produkter minimal, og niveauet af produceret fluorescens kan ikke skelnes væsentligt fra baggrundsfluorescensstøjen. Efterfølgende går produktionen af fluorescens ind i den eksponentielle fase. Mængden af PCR-produkt kan påvises på et bestemt tidspunkt, når reaktionen netop går ind i den eksponentielle fase, som omtales som den "visse produktmængde". Dette kan bruges til at udlede det oprindelige indhold af skabelonen. Derfor er fluorescenssignalintensiteten svarende til den bestemte produktmængde kendt som fluorescenstærsklen.
I de senere stadier af PCR udviser amplifikationskurven ikke længere eksponentiel amplifikation og går ind i den lineære fase og plateaufasen.
3. Reproducerbarheden af Ct-værdier
Når PCR-cyklusserne når antallet af cyklusser, hvor Ct-værdien forekommer, går den netop ind i den sande eksponentielle amplifikationsfase. På dette tidspunkt er mindre fejl ikke blevet forstærket, så reproducerbarheden af Ct-værdier er fremragende. Dette betyder, at uanset om den samme skabelon amplificeres på forskellige tidspunkter eller i forskellige rør på samme tid, forbliver de opnåede Ct-værdier konstante.
Hvad er intervallet af Ct-værdier?
1.Forstærkningseffektivitet En
PCR-amplifikationseffektivitet refererer til den effektivitet, hvormed polymerasen omdanner målgenet til amplifikationsprodukter.Amplifikationseffektiviteten er 100 %, når et DNA-molekyle omdannes til to DNA-molekyler. Amplifikationseffektivitet betegnes almindeligvis som En. For at lette analysen i efterfølgende artikler er her en kort introduktion til de faktorer, der påvirker amplifikationseffektiviteten.
| Påvirkningsfaktorer | Forklaring | Domme |
| A. PCR-hæmmere | 1. Template-RNA'et kan indeholde stoffer, der hæmmer PCR-reaktionen, såsom proteiner eller detergenter, blandt andre. 2. Det cDNA, der opnås efter revers transkription, kan indeholde høje koncentrationer af skabelon-RNA og komponenter af revers transkriptionsreagenserne, som også kunne hæmme efterfølgende PCR. | 1. Tilstedeværelsen af kontaminering kan vurderes ved at måle A260/A280- og A260/A230-forhold eller ved at udføre RNA-elektroforese. 2. Efter revers transkription, om cDNA'et er fortyndet i en vis mængde. |
| B. Urimeligt primerdesign | Primer kan ikke udgløde effektivt. | Tjek om der er dimerer eller hårnålestrukturer i primerne, og om der er uoverensstemmelser; nogle gange er det nødvendigt at være opmærksom på designet, der spænder over introner. |
| C. Uegnet reaktionsprocedure | 1. Primerne kan ikke anneale effektivt. 2. Aktiviteten af DNA-polymerase frigives ikke fuldstændigt. 3. På grund af længerevarende høje temperaturer falder aktiviteten af DNA-polymerase. | 1. Udglødningstemperaturen er højere end primerens Tm-værdi. 2. Præ-denatureringstiden er for kort. 3. Varigheden af hvert trin i reaktionsprotokollen er for lang. |
| D.Reagenser ikke blandet grundigt eller pipetteringsfejl | I reaktionssystemet er den lokale koncentration af PCR-reaktionskomponenter for høj eller ujævn, hvilket resulterer i ikke-eksponentiel amplifikation af PCR. | / |
| E. Amplicon længde | Amplikonlængden er for lang og overstiger 300 basepar, hvilket resulterer i lav amplifikationseffektivitet. | Tjek om amplikonlængden er mellem 80 basepar og 300 basepar. |
| F. Virkningen af qPCR-reagenser | En lavere koncentration af DNA-polymerase i reagenserne eller suboptimale ionkoncentrationer i bufferen resulterer i, at Taq-enzymet ikke når sin maksimale aktivitet. | Standardkurven bruges til at måle amplifikationseffektiviteten af primerne. |
2.Omfanget af Ct-værdier
Intervallet af Ct-værdier er 15-35. En Ct-værdi på mindre end 15 anses for at være inden for basislinjefasen og har ikke nået fluorescensgrænsen. Ideelt set er der et lineært forhold mellem Ct-værdien og logaritmen af skabelonens oprindelige kopinummer, som er kendt som standardkurven. Ved brug af standardkurven, når amplifikationseffektiviteten er 100 %, beregnes Ct-værdien for kvantificering af en enkelt kopi af genet til at være omkring 35. Hvis Ct-værdien er større end 35, er det oprindelige kopital af skabelonen teoretisk mindre end 1, hvilket kan betragtes som statistisk insignifikant.
For forskellige gener kræver Ct-værdiområdet, på grund af variationer i den oprindelige skabelonmængde af genkopier og amplifikationseffektivitet, oprettelsen af en standardkurve for det pågældende gen for at beregne genets lineære detektionsområde.
3.Faktorer, der påvirker Ct-værdier
Som angivet af forholdet mellem antallet af amplifikationscyklusser og mængden af produkt: Amplifikationsproduktmængde = Initial skabelonmængde × (1 + En)^antal cyklusser, kan det ses, at under ideelle forhold vil den initiale skabelonmængde og En påvirke Ct-værdien. Forskelle i skabelonkvalitet eller amplifikationseffektivitet kan forårsage, at Ct-værdien er for høj eller for lav.
4. Ct-værdier er for høje eller for lave
Xiao Yi konsulterede eksperterne i vores virksomheds tekniske afdeling og opsummerede årsagerne og løsningerne til de to almindelige typer problemer med Ct-værdier for at oplyse vores læsere.
| Problem | Årsager | Løsninger |
| Ct-værdien er for høj | Skabelonkoncentrationen er lav, eller der er PCR-hæmmere til stede. Amplifikationseffektiviteten er lav. | 1. Øg skabelonkoncentrationen; eller øge fortyndingsforholdet af RNA eller cDNA; eller klargør skabelonen igen. 2. Sænk annealingstemperaturen, eller brug en to-trins amplifikationsmetode; sikre, at komponenterne og systemet er grundigt blandet; optimere reaktionsprotokollen; eller prøv at udskifte reagenserne. |
| Ct-værdi for lav | 1. Høj skabelonkoncentration 2. Forurening i NTC (ingen skabelonkontrol) og NRC (ingen omvendt kontrol) 3. Uhensigtsmæssig primerdesign | 1. Reducer mængden af skabelon-RNA; eller fortynd cDNA'et i et højere forhold. 2. Udskift alle reagenser igen; eller brug UDGase anti-kontamineringsreagenser. 3. Optimer proceduren for at undgå uspecifik amplifikation. |
Dette afslutter analysen af den unormale Ct-værdi, der forårsager dette problem. Dernæst vil Xiao Yi anbefale en række omkostningseffektive produkter for at sikre, at dine eksperimentelle data er mere nøjagtige og pålidelige. Kom og vælg dine favoritter!
| Produktnavn | Kat# | Størrelse |
| Hieff UNICON™ Universal Blue qPCR SYBR Grøn Master Mix | 11184ES08 | 5×1 ml |
| Hifair™ Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix til qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES60 | 100 T |
| Hifair™ AdvanceFast One-step RT-gDNA Digestion SuperMix til qPCR | 11151ES60 | 100 T |
| Hifair™ AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit (ingen farvestof) | 11150ES60 | 100 T |