Fluorescerende kvantitativ PCR (qPCR) er en almindeligt anvendt teknik i laboratorier, som kan anvendes til genekspressionsanalyse, genotypebestemmelse, patogendetektion, SNP-analyse og mere. Betjeningen af qPCR er enkel, og dens princip er let at forstå. Nu, når man står over for en bunke rodede data, bliver det en skræmmende opgave, hvordan man analyserer resultaterne. I dag vil Xiao Yi guide dig til, hvordan du forenkler komplekse processer og nemt kan få data, der kan publiceres i SCI-tidsskrifter!
Almindelige analysemetoder anvendt i qPCR omfatter relativ kvantificering og absolut kvantificering, og valget mellem disse metoder bør baseres på forskellige eksperimentelle designs. I dette nummer vil vi fokusere på en fælles anvendelse af qPCR——genekspressionsanalyse, hvor den relative kvantificeringsmetode generelt vælges.
Eksperimentelt design
Antag, at vi i øjeblikket skal studere effekten af lysinduktion på ekspressionen af Arabidopsis AtSUC2-genet. Kontrolgruppen ville bestå af Arabidopsis-planter, der ikke har gennemgået nogen behandling, mens forsøgsgruppen vil være planter, der er blevet behandlet med en vis lysinduktion. RNA ville blive ekstraheret fra begge grupper og revers-transkriberet for at opnå cDNA, som derefter ville blive brugt som en skabelon. Arabidopsis GAPDH-genet ville blive udvalgt som en intern reference for qPCR-eksperimentet.
De qPCR-brønde, der skal konfigureres, er som følger:
1) NTC (Ingen skabelonkontrol) bruges til at verificere, om der er kontaminering i PCR-systemet.
2) NRT (Ingen omvendt transkription) henviser til at bruge RNA, der ikke har gennemgået omvendt transkription, som skabelonen, der tjener som kontrol for gDNA-kontamination.
3) Den internt referencegen bruges til at korrigere for forskelle forårsaget af varierende startkoncentrationer af prøver.
4) Udvælgelsen af kontrolprøver falder generelt i følgende kategorier:
- For at vurdere effekten af en bestemt behandling på genekspression, bruges den ubehandlede prøve som referenceprøve.
- For at detektere forskellene i genekspression på forskellige tidspunkter bruges prøven på tidspunkt 0 som referenceprøve.
- For at sammenligne forskellene i genekspression mellem forskellige væv vælges et væv vilkårligt som referenceprøven.
Et punkt at bemærke her er, at for hvert materiale nævnt ovenfor er der opsat 3 PCR-brønde (1, 2, 3). Disse er PCR-duplikater, også kendt som tekniske replikater, som har til formål at eliminere driftsfejl og nøjagtigt evaluere amplifikationseffektiviteten. Derudover skal der etableres biologiske replikater, som involverer at udføre det samme eksperiment på forskellige materialer (forskellige tidspunkter, planter, batches, reaktionsplader) for at kalibrere biologisk variabilitet og analysere, om behandlingen har statistisk signifikans. Specifikt i dette tilfælde kræver både den eksperimentelle gruppe og kontrolgruppen, at mindst to sæt mere Arabidopsis-prøver (A, B, C) skal behandles. RNA ekstraheres fra hvert sæt og revers-transskriberes, efterfulgt af qPCR. Til statistisk analyse anvendes gennemsnittet af de tre biologiske replikater.
Resultatanalyse — ΔΔCt-metode
Det karakteristiske ved ΔΔCt-metoden er, at den udelukkende er afhængig af Ct-værdierne til beregning, men forudsætningen er, at amplifikationseffektiviteten af målgenet og referencegenet skal være relativt konsistente og begge falde inden for området 90-110 %.
Den specifikke beregningsformel er som følger:
ΔCt = Ct (målgen) - Ct (referencegen)
ΔΔCt = ΔCt (eksperimentel gruppe) - ΔCt (kontrolgruppe)
RQ = 2^(-ΔΔCt)
Forudsat at ovenstående eksperiment studerer effekten af lysinduktion på ekspressionen af Arabidopsis AtSUC2-genet, er resultaterne af qPCR som følger:
Under beregningen beregner vi først gennemsnittet af 2^-△Ct-dataene for kontrolgruppen (som vist i figuren ovenfor, som er 0,00116). Derefter dividerer vi hver værdi af 2^-△Ct med dette gennemsnit for at opnå værdien af 2^-△△Ct. Endelig organiserer vi disse værdier for at opnå middelværdi og standardafvigelse, hvilket indikerer, at ekspressionsniveauet af målgenet i den eksperimentelle gruppe er øget med ca. 9,73 gange sammenlignet med kontrolgruppen.
Resultaterne plottes ved hjælp af Graphpad-software som følger:
P-værdien beregnet ved hjælp af softwarens t-test er 0,0024, hvilket er mindre end 0,05, hvilket indikerer en statistisk signifikant forskel, og resultaterne er pålidelige.
Resultatanalyse — Dobbelt standardkurvemetode
I praktiske anvendelser, da amplifikationseffektiviteten af målgenet og referencegenet ofte er forskellig, er det nødvendigt at redesigne primere og optimere reaktionsbetingelserne for at opnå den samme amplifikationseffektivitet. Men vi kan også vælge en mere bekvem metode, dual-standard curve-tilgangen.
Lad os her først forstå analysemetoden til absolut kvantificering. De specifikke trin er at amplificere målfragmentet gennem PCR, derefter indsætte målfragmentet i en kloningsvektor, ekstrahere det rekombinante plasmid, og efter sekventering bekræfter, at det er korrekt, kan det bruges som standard. Mængden af plasmid-DNA kan måles ved hjælp af instrumenter som Nanodrop, og kopiantallet konverteres til specifikke plasmidkopier ved hjælp af formlen for konvertering af kopital. Derefter amplificeres DNA'et efter en række fortyndinger. En standardkurve plottes med logaritmen af standardkopitallet som x-aksen og de målte Ct-værdier som y-aksen. Baseret på Ct-værdien af den ukendte prøve kan dens absolutte kopiantal beregnes.
Formel til beregning af kopital:
Kopital = (masse ÷ relativ molekylmasse) × 6,02 × 10^23
Dual-standard kurvemetoden involverer separat konstruktion af standardprøver for målgenet og referencegenet, udførelse af absolut kvantificering og oprettelse af standardkurver. Efter at have beregnet det absolutte kopiantal af de ukendte prøver, foretages en sammenligning, hvilket giver højere nøjagtighed.
Den specifikke beregningsformel er som følger:
Q = Antal målgenkopier / Antal referencegenkopier
RQ = Q (eksperimentel) / Q (kontrol)
I det ovenfor nævnte forsøg, som undersøger effekten af lysinduktion på ekspressionen af Arabidopsis AtSUC2-genet, blev standardprøver for både AtSUC2 og GAPDH konstrueret, og følgende standardkurver blev fremstillet:
Ct-værdierne for målgenet og det interne referencegen i prøverne, der skal testes, er som følger:
Under beregningen erstattes først Ct-værdierne af målgenet og det interne referencegen i det lineære forhold af standardkurven for at opnå de absolutte kopital af målgenet og det interne referencegen i både forsøgs- og kontrolgruppen. Derefter normaliseres ekspressionsniveauet af målgenet ved at bruge formlen Q = antal målgenkopier / antal referencegenkopier.Endelig, ifølge formlen RQ = Q (eksperimentel) / Q (kontrol), beregnes RQ til at være 9,71, hvilket indikerer, at ekspressionsniveauet af målgenet i forsøgsgruppen er 9,71 gange højere end i kontrolgruppen.
Resultaterne plottes ved hjælp af GraphPad-software som følger:
P-værdien beregnet ved hjælp af softwarens t-test er 0,0008, hvilket er mindre end 0,05, hvilket indikerer en statistisk signifikant forskel, og resultaterne er pålidelige.
Det afslutter qPCR-dataanalysen for denne session. Dernæst vil jeg anbefale en række omkostningseffektive produkter for at sikre, at dine eksperimentelle data er mere nøjagtige og pålidelige. Kom og hent dem!
| Produktnavn | Kat# | Størrelse |
| Hieff UNICON™ Universal Blue qPCR SYBR Grøn Master Mix | 11184ES08 | 5×1 ml |
| Hifair™ Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix til qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES60 | 100 T |
| Hifair™ AdvanceFast One-step RT-gDNA Digestion SuperMix til qPCR | 11151ES60 | 100 T |
| Hifair™ AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit (ingen farvestof) | 11150ES60 | 100 T |