Gennembrudspræstation fra Yeasen og Molefuture bioteknologi
Med den hurtige udvikling af bioteknologi har mRNA-terapi, som en ny behandlingsmetode, tiltrukket sig stor opmærksomhed på grund af dens stærke programmerbarhed og hurtige responshastighed. Inden for områder som mRNA-vacciner og genterapi er effektiv syntese af højkvalitets-mRNA et afgørende skridt i at nå terapeutiske mål. I denne proces spiller T7 RNA-polymerase en afgørende rolle, da den effektivt kan katalysere in vitro-syntesen af mRNA.
Problemet med dsRNA-biproduktet af T7 RNA-polymerase
Selvom T7 RNA-polymerase spiller en vigtig rolle i mRNA-syntese, resulterer den faktiske operation ofte i produktionen af dobbeltstrenget RNA (dsRNA) som et biprodukt. Tilstedeværelsen af dsRNA reducerer ikke kun udbyttet og renheden af mRNA, men kan også udløse uspecifikke immunresponser, hvilket påvirker effektivitet og sikkerhed. Derfor er reduktion af produktionen af dsRNA blevet et presserende behov i industrien. I øjeblikket omfatter metoder til at reducere dsRNA hovedsageligt optimering af reaktionsbetingelser og brug af hjælpeenzymer. Selvom disse metoder kan reducere produktionen af dsRNA til en vis grad, kommer de ofte med problemer som kompleks drift og øgede omkostninger.
Hvorfor skal vi lave T7 RNA polymerase engineering?
Direkte modifikation af T7 RNA-polymerase for at reducere dsRNA-produktion er en mere fundamental løsning. Enzymstyrede evolutionsteknikker kan forbedre dets katalytiske egenskaber og øge renheden og udbyttet af produkter ved præcist at ændre enzymets aminosyresekvens eller struktur. For T7 RNA-polymerase kan målrettet modifikation ikke kun reducere dsRNA-produktion, men også øge den overordnede effektivitet og kvalitet af mRNA-syntese.
Som leverandør af mRNA in vitro syntese råmaterialer, Yeasen Bioteknologi, og dets datterselskab Molefuture Bioteknologi, have udviklet en ny T7 RNA-polymerase - ved at bruge den ZymeEditor-styrede udviklingsplatform. For at minimere produktionen af biprodukter såsom dsRNA under in vitro-transkriptionsprocesser, har evolution-teamet konstrueret T7 RNA-polymerase gennem en kombination af rationelt design og rettet screening.
Hvordan genererer dsRNA?
Ifølge litteraturrapporter stammer produktionen af biproduktet dsRNA hovedsageligt fra to kilder (Figur 1): Den første er under overgangen af T7 RNA-polymerase fra initieringskonformationen til forlængelseskonformationen i de tidlige stadier af transkriptionen, det ternære transkriptionskompleks er tilbøjeligt til at dissociere [1], hvilket resulterer i frigivelsen af et stort antal RNA med et stort antal RNA (A) 20 nt ind i systemet. Disse RNA-kæder fungerer som "primere", komplementær parring med lange RNA-kæder og strækker sig til at producere dsRNA under påvirkning af T7 RNA-polymerases RNA-afhængige RNA-polymeraseaktivitet (RDRP-aktivitet) [2,3]. Den anden kilde udløses af den terminale ribonukleotidoverførselsaktivitet, som T7 RNA-polymerase besidder. Når transkriptionsreaktionen når den lineære skabelons ende, kan T7 RNA-polymerase tilfældigt tilføje flere ribonukleotider uden skabelonafhængighed. Disse ribonukleotider, der danner "tilfældige primere", kan omvendt-folde og komplementært parre sig med mål-mRNA-regionen og strække sig til at producere dsRNA. DsRNA'et produceret gennem looping kaldes loopback dsRNA [3,4]. Derfor, for at reducere dsRNA-biprodukter, ligger fokus for T7 RNA-polymerase-modifikation i stabilisering af det tidlige transkriptions-ternære kompleks eller svækkelse af den terminale overførselsaktivitet og RNA-afhængige RNA-polymerase (RDRP) aktivitet af T7 RNA polymerase.
Figur 1. Skematisk diagram af energibarriere og dsRNA-dannelsesprincip (upublicerede data)
Hvordan man overvinder energibarriere af T7 RNA-polymerase konformationel overgang?
Gennem strukturel og fri energianalyse opdagede holdet på den ene side, at sammen med de konformationelle ændringer af T7 RNA-polymerase er der også en ændring i energi. Den frie energi af forlængelseskonformationen er signifikant højere end initieringskonformationens energi, hvilket indikerer, at transkriptionsprocessen skal overvinde en højere energibarriere for at producere komplette mRNA-kæder. En høj energibarriere er ugunstig for jævn konformationel overgang. Derfor udnyttede holdet rationel screeningsmetoder til at identificere over 20 hotspot-aminosyrer og konstruerede tilsvarende mætningsmutagenesebiblioteker.
Sådan ændres terminal overførsel og RDRP-aktiviteter af T7 RNA-polymerase
På den anden side, i betragtning af de begrænsede rapporter om funktionerne, stederne og strukturelle domæner relateret til den terminale overførsel og RDRP-aktiviteterne af T7 RNA-polymerase, og fordi disse to aktiviteter, som er funktionelt ens, sandsynligvis deler nøglesteder med hovedreaktionen af T7 RNA-polymerase - transkriptionsaktivitet (dvs. DNA-afhængig RNA-polymerisationsaktivitet, DDRP) - er det svært at finde direkte aminosyre-site-aktivitet for modifikation af hotspots for aminosyrer. Derfor konstruerede teamet samtidigt adskillige tilfældige mutationsbiblioteker baseret på fejltilbøjelige PCR, kombineret med high-throughput evolution kapaciteten af ZymeEditor platformen, hvilket resulterede i en diversitet på over 10^6 for hvert enkelt bibliotek.
Sondebaseret opdagelse af ideal T7 RNA polymerase
For at afbalancere produktionen af T7 RNA-polymerase og overvåge indholdet af dsRNA i in vitro transkriptionsreaktionen har teamet, med henvisning til optimerede transkriptionsskabeloner, omhyggeligt designet flere fluorescerende prober, der målretter mod forskellige regioner af mål-mRNA-produkterne. Disse prober forbinder information såsom reaktionsudbytte, integritet og dsRNA-indhold i systemet med fluorescenssignaler. Jo stærkere systemets fluorescensintensitet er, jo mere fordelagtig er mutantens ydeevne. I teorien kan denne screeningsmetode rangere mutanter baseret på fluorescensintensiteten af forskellige prober, opnå T7 RNA-polymerasemutanter med højt udbytte eller reduceret abortivt RNA, såvel som mutanter med forbedret integritet eller reduceret loopback-dsRNA. Når reaktionsskabelonen erstattes med RNA, kan mutanter med reduceret RDRP-aktivitet også screenes negativt, hvilket forbedrer skabelonselektiviteten af T7 RNA-polymerase. Ved at tilføje modificerede nukleotider, cap-analoger og øge reaktionstemperaturen i dråbereaktionssystemet kan yderligere screening udføres for at vælge T7 RNA-polymerasemutanter, der tolererer ikke-naturlige substrater og udviser forbedret termisk stabilitet.
Sådan screenes bedst T7 RNA polymerase?
Ud fra størrelsen af bibliotekerne, teamet udviklet ultra-high-throughput screeningsprocesser baseret på fluorescensaktiveret dråbesortering (FADS) og high-throughput screeningsprocesser baseret på traditionelle mikroplademetoder (MTPS).Gennem flere forsøgsrunder blev over 10^7 mutanter screenet i alt, hvilket resulterede i flere mutanter med signifikant reduceret dsRNA-indhold. Blandt dem viste nogle mutanter et fald i dsRNA forårsaget af abortivt RNA i reaktionen, hvilket tyder på, at forlængelseskonformationen af disse polymerasemutanter er mere stabil. Nogle mutanter viste et fald i loopback-dsRNA-indhold i reaktionen, hvilket indikerer en svækkelse af terminal overførselsaktivitet eller RDRP-aktivitet i disse mutanter.
I betragtning af at præstationsfordelene ved de førnævnte mutanter stammer fra forskellige mekanismer, holdet har konstrueret DNA-shuffling-biblioteker rettet mod dem. Efter screening, holdet endelig opnåede overlegne mutanter med ekstrem lav dsRNA-generering uden at påvirke udbyttet og mRNA-integriteten (figur 2). Imidlertid blev udbyttet af en mutant G47A+884G opdaget af Moderna påvirket[5] (upubliceret).
Figur 2. Enzymudviklingsproces og karakterisering af mutantydelse
(upubliceret)
Analyse af dsRNA-generering ved T7 RNA polymerase varianter?
Efter kvantitativ analyse, som vist i figur 3, under anvendelse af en 9 kb transkriptionsskabelon under co-transkriptionsafdækningsbetingelser, producerede vildtype T7 RNA-polymerasen ca. 2,9 ng/μg dsRNA ved anvendelse af naturlige nukleotider, mens en kommerciel T7 enzym produceret omkring 0,18 ng/μg dsRNA. Imidlertid er dsRNA-produktionen af hver T7 RNA-polymerasevariant konstrueret var mindre end 0,10 ng/μg. Især en variant var kun 0,015 ng/μg, næsten 200 gange lavere end vildtypen og 12 gange lavere end den kommercielle produkt. Efter gentagne tests blev varianternes ydeevnefordel i at reducere dsRNA konsekvent observeret under forskellige reaktionsbetingelser, hvilket indikerer god systemkompatibilitet af disse mutanter og lægger et grundlag for yderligere at reducere dsRNA-produktion gennem reaktionsbuffer optimering. Derudover opnåede FADS-screening også flere varianter med forbedret produktintegritet og termisk stabilitet, som kan opfylde kravene til en bredere række af in vitro-transskriptionsapplikationer
Figur 3. Evaluering af dsRNA-generering ved hjælp af T7 RNA-polymerasevarianter vurderet ved hjælp af Yeasen Dobbeltstrenget RNA (dsRNA) ELISA Kit og J2 antistof dot blot-analyse.
På nuværende tidspunkt har flere partnere allerede prøvet T7 RNA polymerase varianterne, og vi har modtaget stor ros fra dem. Brugen af det nye enzym forenkler mRNA-oprensningsprocessen, øger arbejdseffektiviteten og demonstrerer enestående ydeevne i flere anvendelsesscenarier.
Om Molefuture Biotechnology
Molefuture Biotechnology er et datterselskab af Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., der har specialiseret sig i at levere tilpassede enzymmodifikationsløsninger drevet af enzymevolutionsteknologi.Udnyttelse af Yeasens ressourcer Bioteknologi, Molefuture opererer på seks store teknologiske platforme: ZymeEditor innovative enzymudviklingsplatform, en multi-host højeffektiv ekspressionsplatform, fermenteringsprocesudviklingsplatform, oprensningsprocesudviklingsplatform, ultra-rent enzymproduktionsplatform og enzymanalyse- og kvalitetskontrolplatform. Med disse seks teknologiske platforme kan Molefuture tilbyde et komplet sæt af skræddersyede løsninger, herunder enzymstyret evolution, udvikling af nye enzymer, udvikling af enzymprocesser og GMP-niveau opskalering for at imødekomme applikationskravene til enzymer inden for områder som in vitro-diagnostik, biomedicin, syntetisk biologi, medicinsk æstetik, farmaceutiske mellemprodukter, etiske mellemprodukter. al.
Bestillingsinformation
Følgende er repræsentative produkter, der tilbydes af Yeasen. Yderligere størrelser er tilgængelige. Vores produkter er yderst optimeret til at fungere sammen, for at sikre overlegen ydeevne og reproducerbarhed. Vi kan også levere skræddersyede tjenester. Hvis du er interesseret i et produkt, der ikke er vist, så kontakt os, og vi vil arbejde sammen med dig for at opfylde dine behov.
Angående læsning:
Referencer: