Deling af valideringsrapporten for det dobbeltstrengede RNA (dsRNA) ELISA-kit for at fremme standardiseringen af ​​dsRNA-detektion.

Leder du efter en pålidelig måde at detektere resterende dsRNA under mRNA in vitro transkription? Se ikke længere end det dobbeltstrengede RNA (dsRNA) ELISA Kit. Men med flere tilgængelige kommercielle kits er det vigtigt at bemærke, at valideringsdata muligvis ikke altid er offentligt tilgængelige, hvilket fører til inkonsekvens i dsRNA-detektion. Det er derfor, vi deler vores valideringsrapport af The Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA Kit, der dækker specificitet, præcision, nøjagtighed, sensitivitet og holdbarhed. Denne rapport tjener som en referencevejledning til at validere dsRNA-restpåvisningsmetoder, der er skræddersyet til specifikke eksperimentelle forhold og regulatoriske farmakopéstandarder. Læs mere om vores valideringsrapport at fremme standardiseringen af ​​dsRNA-detektion.

Dobbeltstrenget RNA (dsRNA) ELISA Kdet

Baggrund:

Dobbeltstrenget RNA (dsRNA) ELISA-kittet er et reagenskit designet til at detektere det resterende dsRNA produceret under mRNA in vitro-transkriptionsprocessen. Ved at anvende det eksperimentelle princip med dobbelt antistof sandwich enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) og biotin-streptavidin amplifikationssystemet tilbyder dette kit følsom påvisning af resterende dsRNA i prøver.

Opsummeringsdataene indeholder valideringsparametre, der dækker specificitet, præcision, nøjagtighed, følsomhed og holdbarhed. Rapporten fungerer som en referencevejledning, der opfordrer brugerne til at validere dsRNA-restpåvisningsmetoder, der er skræddersyet til deres specifikke eksperimentelle forhold og overholder lovmæssige farmakopéstandarder.

Materialer og metoder:

Kit: Dobbeltstrenget RNA (dsRNA) ELISA Kit: Kat #36717ES (YEASEN). Sættet indeholder fire forskellige typer af dsRNA-standardprøver. Brugere har mulighed for at vælge den standardprøvetype, der stemmer overens med deres specifikke proces til generering af standardkurven, og derved undgår nødvendigheden af ​​at forberede og teste alle prøver.

Metoder: Materialerne og de proceduremæssige trin, der er afgørende for eksperimentet, er overvejende specificeret af Yeasen Biotechnology. Sættet har gennemgået omfattende test og evaluering, hvilket sikrer, at dets ydeevne opfylder de fastsatte krav i ICH Q2(R1) og 2020-udgaven af ​​den kinesiske farmakopé, del fire "9101 Analytical Method Validation Guidelines".

Resultater

  1. Linearitet af dsRNA-standarder

Denne rapport har udviklet standardkurver for alle fire forskellige typer af dsRNA-standarder, hver med en længde på 300 bp. Disse standarder inkluderer STD1, umodificeret dsRNA; STD2, Pseudo-UTP modificeret dsRNA; STD3, N1-Me-Pseudo-UTP modificeret dsRNA; og STD4, 5-OMe-UTP modificeret dsRNA. Hver type dsRNA-standard udviser fremragende linearitet af fortynding med R2 > 0,99 og en variationskoefficient (CV) af målt koncentration på mindre end 10 % vist i tabel 1 til tabel 5.

STD navn

UTP type

Linearitet af fortynding (R2＞0,99)

CV

STD1

UTP

0.0156-1 pg/μL

＜10 %

STD2

pUTP

0,0156-1 pg/μL

＜10 %

STD3

N1-Mig-pUTP

0,0312-1 pg/μL

＜10 %

STD4

5-OMe-UTP

0,0625-1 pg/μL

＜10 %

Tabel 1. Lineariteten af ​​forskellige dsRNA-standarder.

STD1 koncn. (pg/μL)

Målt middelværdi (pg/μL)

Genopretning

CV

1

1.0001

100,0 %

3,1 %

0,5

0,4994

99,9 %

2,4 %

0,25

0,2516

100,7 %

3,3 %

0,125

0,1227

98,1 %

0,5 %

0,0625

0,0640

102,5 %

3,2 %

0,0312

0,0309

99,2 %

1,3 %

0,0156

0,0157

100,4 %

3,2 %

0

/

/

/

Tabel 2.Opsvinget og CV af fortyndet STD1

STD2 koncn. (pg/μL)

Målt middelværdi (pg/μL)

Genopretning

CV

1

1.0001

100,0 %

0,7 %

0,5

0,4994

99,9 %

0,1 %

0,25

0,2514

100,6 %

0,9 %

0,125

0,1232

98,6 %

2,5 %

0,0625

0,0635

101,6 %

1,1 %

0,0312

0,0312

99,9 %

0,5 %

0,0156

0,0155

99,6 %

0,0 %

0

/

/

/

Tabel 3. Gendannelsen og CV af fortyndet STD2

STD3 konn. (pg/μL)

Målt middelværdi (pg/μL)

Genopretning

CV

2

2,0031

100,2 %

1.6 %

1

0,9880

98,8 %

2,4 %

0,5

0,5188

103,8 %

1,2 %

0,25

0,2383

95,3 %

2,2 %

0,125

0,1242

99,4 %

0,1 %

0,0625

0,0629

100,7 %

1,8 %

0,0312

0,0361

115,7 %

1,6 %

0

/

/

/

Tabel 4. Gendannelsen og CV af fortyndet STD3

STD4 konn. (pg/μL)

Målt middelværdi (pg/μL)

Genopretning

CV

4

4,0096

100,2 %

1,9 %

2

1,9940

99,7 %

0,7 %

1

0,9977

99,8 %

0,1 %

0,5

0,5108

102.2 %

0,1 %

0,25

0,2454

98,2 %

5,6 %

0,125

0,1207

96,5 %

2,8 %

0,0625

0,0624

99,9 %

0,3 %

0

/

/

/

Tabel 5. Gendannelsen og CV af fortyndet STD4

  1. Specificitet

  • Specificitetsanalyse med dsRNA, ssRNA, dsDNA og ssDNA.
Figur 1. Sættet identificerer udelukkende dsRNA og detekterer ikke ssRNA, dsDNA eller ssDNA.

  • Specificitet blev ikke påvirket af længden af ​​dsRNA'er.
Figur 2. Specificiteten af ​​kittet forbliver konsistent på tværs af dsRNA'er med forskellig længde (160 bp og 500 bp).

  1. ENnøjagtighed

Tilføjelse af 0,5 pg/μL STD1 til en kendt mRNA-prøve med et dsRNA-indhold på 0,36 pg/μL blev udført i tre forskellige volumenforhold (1:1, 1:20, 1:250). I alle tilfælde faldt spidsgenvindingsraterne inden for intervallet 80-120 %.

Spidsgenvindingshastigheden beregnes som følger: Spike Genopretning Rate=(Målt koncentration efter spiking×Total bind af spidse prøve-målt koncentration af de stikprøve×I alt bind af de prøve)/(Teoretisk koncentration af de spike×Volume af de spids) × 100 %

Prøver

Volumenforhold af STD1/prøve

Målt dsRNA (pg/μL)

Spike Genopretning Sats

Eksempel (TS)

/

0,36

/

TS+0,5pg/μL STD1

1:1

0,769

81 %

TS+0,5pg/μL STD1

1:20

0,777

82 %

TS+0,5pg/μL STD1

1:250

0.803

82 %

Tabel 6. Spikegenvindingshastigheden analyse

  1. Præcision

  • Intra-assay præcision

Eksperimenter blev udført på tre koncentrationsniveauer (høj, medium og lav) for hver af de fire dsRNA-standardprøver. Inden for et enkelt eksperiment gennemgik hver koncentrationsprøve otte gentagne tests. Resultaterne viser, at variationskoefficienten (CV) er under 15 % indikerer en god intra-assay præcision.

STD1

Teoretisk konk. (pg/μL)

Replikerer

Målt gennemsnit (pg/μL)

CV

1

8

1.0002

3,11 %

0,125

8

0,1230

0,46 %

0,0156

8

0,0164

3,18 %

STD2

Teoretisk konk. (pg/μL)

Replikerer

Målt gennemsnit (pg/μL)

CV

1

8

1.0001

0,65 %

0,125

8

0,1231

2,46 %

0,0156

8

0,0162

0,02 %

STD3

Teoretisk konk. (pg/μL)

Replikerer

Målt gennemsnit (pg/μL)

CV

2

8

2,0022

1,58 %

0,25

8

0,2444

2,17 %

0,0312

8

0,0328

1,64 %

STD4

Teoretisk konk. (pg/μL)

Replikerer

Målt gennemsnit (pg/μL)

CV

8

8

8,0803

0,27 %

1

8

0,9650

0,12 %

0,125

8

0,1322

2.76 %

Tabel 7. Intra-assay præcisionsanalyse

  • Inter-assay præcision

Tre eksperimenter blev udført ved hjælp af kits fra 3 partier. I hvert eksperiment blev høje, mellemstore og lave koncentrationer valgt og testet tre gange for hver af de fire dsRNA-standardprøver med otte replikater. Derfor blev der indsamlet 24 datapunkter ved hver koncentrationsniveau, som derefter blev brugt til analyse af variationskoefficient (CV). Resultaterne viser, at CV for hver koncentration af standarderne var under 15%.

STD1

Teoretisk konk. (pg/μL)

Uafhængige tests/replikater

Målt gennemsnit (pg/μL)

CV

1

3/8

1,0007

2,38 %

0,125

3/8

0,1186

3,20 %

0,0156

3/8

0,0173

1,27 %

STD2

Teoretisk konk. (pg/μL)

Uafhængige tests/replikater

Målt gennemsnit (pg/μL)

CV

1

3/8

0,9987

0,09 %

0,125

3/8

0,1269

1,06 %

0,0156

3/8

0,0151

0,52 %

STD3

Teoretisk konk. (pg/μL)

Uafhængige tests/replikater

Målt gennemsnit (pg/μL)

CV

2

3/8

2,0012

2,37 %

0,25

3/8

0,2415

0,14 %

0,0312

3/8

0,0330

1,81 %

STD4

Teoretisk konk. (pg/μL)

Uafhængige test/replikater

Målt gennemsnit (pg/μL)

CV

8

3/8

7,9735

1,89 %

1

3/8

1,0225

0,13 %

0,125

3/8

0.1227

5,63 %

Tabel 8. Præcisionsanalyse mellem assays

  1. Følsomhed

  • LOD

Detektionsgrænsen for sæt bestemmes ved at lægge to gange standardafvigelsen til middelværdien af ​​blankværdierne. Ved at måle OD for 24 blindprøver, beregne deres middelværdi og standardafvigelse og derefter anvende disse værdier på den tilpassede kurve, den tilsvarende detektionsgrænse opnås.

OD

dsRNA Standard

Middel af Blank

SD af Blank

Gennemsnit af Blank+2SD

LOD

STD1

0,016

0,00048

0,01696

≤0,001 pg/μL

STD2

0,016

0,00072

0,01744

≤0,001 pg/μL

STD3

0,034

0,00119

0,03638

≤0,001 pg/μL

STD4

0,115

0,00290

0,1208

≤0,01pg/μL

Tabel 9. LOD-analyse

  • LOQ

Den kvantitative grænse for sæt etableres ved at fortynde standardkurvens laveste koncentrationspunkt til endnu lavere niveauer, hvilket sikrer en CV < 20 % ved den laveste koncentration, hvorved den kvantitative tærskel defineres. LOQ er som følgende.

dsRNA Standard

LOQ

Replikerer

CV(%)

Genopretning (%)

STD1

0,0156 pg/μL

24

＜10 %

80~120 %

STD2

0,0312 pg/μL

24

＜10 %

80~120 %

STD3

0,0156 pg/μL

24

＜10 %

80~120 %

STD4

0,125 pg/μL

24

＜10 %

80~120 %
Tabel 10.LOQ analyse

  1. Dholdbarhed

  • Anti-interferens på IVT-materialer

Denne test havde til formål at vurdere virkningen af ​​forskellige enzymer, buffere osv., der tilsættes til mRNA prøve på dsRNA-detektion af sættet.

Tilføjelse af specifikke koncentrationer af T7 RNA polymerase, RNAse inhibitor, IPPA (uorganisk pyrophosphatase), DNase I, VCE (vaccinia capping enzym), 2'-O-Methyltransferase (MT), 1×IVT buffer og 1mM natriumcitrat til en medfølgende mRNA prøve og efterfølgende anvendelse af STD3 til både standardkurveforberedelse og prøvetestning muliggjorde evalueringen af ​​sættets evne til at detektere dsRNA-indhold i disse prøver. Resultaterne viser, at tilstedeværelsen af ​​otte forskellige enzymer og buffere ikke påvirkede den nøjagtige påvisning af dsRNA. Derudover faldt de observerede genvindingsrater inden for intervallet 80 % til 120 %.

IVT materialer

dsRNA Målt (pg/μL)

Genopretning

Ingen

0,6057

100 %

T7 RNA-polymerase (15 μg/mL)

0,5411

89,32 %

Murin RNase-hæmmer (27,5 μg/mL)

0,5142

84,88 %

Uorganisk pyrophosphatase (IPPA 10μg/mL)

0,7132

117,7 %

DNase I (13,75 μg/ml)

0,6077

100,32 %

Vaccinia capping enzym (10 μg/mL)

0,6563

108,3 %

2´-O-Methyltransferase (10 μg/ml)

0,5776

95,4 %

1×IVT buffer

0,5003

82,6 %

1 mM Natriumcitrat

0,6251

103,2 %

Tabel 11. Genvinding af fortyndet STD3 tilsat IVT-materialer

  • Temperatur dholdbarhed

Sættene blev opbevaret hos begge 4°C og 37°C at detektere koncentrationsafvigelserne af dsRNA-standard efter 7 dage. Resultaterne viser, at afvigelserne alle er inden for 20 %.

dsRNA Standard

dsRNA Målt (pg/μL) Dag 0

Varianserne efter 7 dage ved 4°C

STD1

1

10 %

STD2

1

5 %

STD3

2

7 %

STD4

4

11 %

dsRNA Standard

dsRNA Målt (pg/μL)

Varianserne efter 7 dage ved 37°C

STD1

1

18 %

STD2

1

4 %

STD3

2

5 %

STD4

4

8 %

Tabel 12. Temperaturholdbarhedsanalyse


      Relateret produkt:

      Produktnavn SKU Specifikationer
      Dobbeltstrenget RNA (dsRNA) ELISA kit 36717ES 48T/96T
      CleaScrip™ T7 RNA-polymerase (lav ds RNA, 250 U/μL) 10628ES 10/100 KU
      T7 RNA polymerase GMP-grad (250 U/μL) 10625ES 10/100 KU

      Relateret læsning:

      Det dobbeltstrengede RNA (dsRNA) ELISA-kit blev anvendt til at validere T7-RNA-polymerasemutanter med lavt dsRNA i forbindelse med J2-antistof-dot blot-metoden.

      Lav dsRNA T7 RNA polymerase mutanter, styrker mRNA vaccine og terapi udvikling


      Referencer:

      1. ICH, 2022: Analytisk metodevalidering Q2, udkast til version.
      2. NMPA, 2007: Generelle principper for evaluering af analytisk metodevalidering til biologisk produktkvalitetskontrolanalyse
      3. Chinese Pharmacopoeia Commission (ChPC), 2020: Chinese Pharmacopoeia, Del fire: Retningslinjer for validering af kvantitative analysemetoder for biologiske prøver

      Forespørgsel