I de senere år har mRNA-baserede lægemidler fået betydelig opmærksomhed og tiltrukket forskningsfokus. T7 RNAP er kendt for sin enkelhed og evne til at katalysere RNA-syntese med højt udbytte og troskab in vitro. Men under transkriptionsprocessen kan T7 RNAP producere biprodukter såsom abortive korte RNA'er, for tidligt terminerede RNA'er og 3'-forlængede RNA'er, hvilket skaber gunstige betingelser for dannelsen af dsRNA. Derfor er reduktion af produktionen af dsRNA blevet et presserende behov i praktiske anvendelser.
For nylig har en banebrydende undersøgelse med titlen "FADS og semi-rationelt design modificeret T7 RNA polymerase reducerede dsRNA produktion med lavere terminal transferase og RDRP aktiviteter" blev udgivet online af Yeasen og Molefuture Team. Forskere konstruerede med succes T7 RNAP til signifikant at reducere produktionen af dsRNA-biprodukter under transkription, hvilket reducerede det til 1,8% af vildtype-enzymet gennem en kombination af rettet evolution og semi-rationelt design.
FADS-baseret screening af T7 RNAP
Til screening af T7 RNAP blev FADS (Fluorescensaktiveret dråbesortering) valgt for at opfylde kravene til høj gennemstrømning af proteinudvikling. For at forhindre for tidlig fragmentering af celler brugte forskere en PDMS-chip med dobbelte vandige faser, hvor lysozym blev blandet med cellerne på chippen og udøvede sin aktivitet i dråberne Figur 1. Forskere genererede flere tilfældige mutantbiblioteker med en mangfoldighed, der spænder fra 105 til 106Efter screening blev 10 dominerende varianter identificeret og betegnet som Mut1 til Mut10. Som vist i Figur 2E og Figur 2F, var dsRNA-indholdet af Mut1, Mut7 og Mut9 signifikant lavere end for vildtypen
Figur 1. Oversigt over FADS
Figur 2. Tilfældig biblioteksscreening og variantevaluering
Semi-rationelt design af T7 RNAP
Forskere gennemførte en semi-rationel designudforskning, skabte ti enkeltsteds mættede biblioteker og anvendte den traditionelle mikrotiterplade-baserede dobbeltprobemetode til screening (Figur 3). Den tilføjede 5'-ende-probe anvendes til påvisning af RNA-udbytte.
Figur 3. Strukturstyret semi-rationelt design for nedsat dsRNA
Efter screening af over 1000 mutanter, forskere identificerede seks kandidater: Mut11 (K180E), Mut12 (S228F), Mut13 (G238L), Mut14 (A70Q), Mut15 (A383H) og Mut16 (I743L). Det samlede RNA-udbytte af alle seks mutanter afveg ikke signifikant fra vildtypen, hvilket indikerer sammenlignelig overordnet transkriptionseffektivitet. Forventet var dsRNA-indholdet af Mut11 og Mut14 signifikant lavere sammenlignet med vildtype(Figur 4).
Figur 4. Mikrotiterpladescreening og variantevaluering
Mut17 fra DNA-shuffling giver mindre dsRNA
For yderligere at optimere T7 RNAP'en blev de fire varianter med lavt dsRNA indhold, mens de opfylder produktionskravene, udvalgt.Forskere konstruerede derefter et DNA-shuffling-bibliotek og screenede med mikrotiterplader, identificerede en variant, der udviste lavere dsRNA-produktion sammenlignet med dets parentale T7 RNAP, kaldet Mut17 (A70Q/F162S/K180E). De analyserede efterfølgende transkriptionsprodukterne af Mut17 og dets forældrevarianter (Mut14, Mut11 og Mut7). Som vist i Figur 5, udviste alle fire varianter signifikante reduktioner i dsRNA-produktion under transkription sammenlignet med vildtypen. Bemærkelsesværdigt viste Mut17 signifikant lavere dsRNA-indhold på kun 1,80% og så lavt som 0,007 ng/μg i opløsningsmiddelsystemet til screening.
Figur 5. dsRNA-indhold af Mut17 og dets forældremutationer
Immunogeniciteten af IVT-produktet fra mutanten er signifikant lavere end vildtypens.
Næste, Vi evaluerede immunogeniciteten af IVT-produkterne i murin RAW264.7 celler. Som vist i figur 2A og 2B blev IFN-β mRNA og proteinniveauer reduceret i RAW264.7 celler transficeret med mRNA produceret af mutanter sammenlignet med vildtype, hvilket indikerer, at mRNA syntetiseret af vildtype T7 RNAP fremkaldte det stærkeste immunrespons, mens mRNA fra mutanterne viste en signifikant reduceret respons. Specifikt var IFN-β-mRNA fra celler behandlet med Mut11 RNA kun 9,7 % af de vildtypebehandlede celler, og dets protein var 12,93 pg/ml. Desuden viste ekspressionen af EGFP ingen signifikante forskelle i mængde eller kvalitet blandt mRNA'er genereret af forskellige T7 RNAP'er (Figur 6C), der opfylder kravene til industrielle anvendelser.
Figur 6. IFN-β-respons og EGFP-ekspression i pattedyrsceller
Mutantens RDRP og terminale transferaseaktiviteter er meget ringevir end dem af vildtypen.
For at undersøge virkningen af mutationer på at reducere dsRNA, forskere udført i silico undersøgelser af alle disse mutationer. Resultatet tyder på en klar indikation af reduceret RDRP-aktivitet i varianterne, da de viser en nedsat tendens til at anvende RNA som skabelon. På samme måde kan dette have haft en indvirkning på den terminale transferaseaktivitet af T7 RNAP. Som vist i Figur 7under forskellige koncentrationer udviste alle 4 varianter mindre end 50 % af fluorescensværdien sammenlignet med vildtypen.
Efterfølgende blev et 3'-ende-heterogenitetsassay anvendt til at karakterisere den terminale overførselsaktivitet af T7 RNAP. Når der fokuseres på andelen af RNA med n>0, hvilket afspejler den terminale transferaseaktivitet, forskerne fandt, at disse RNA'er tegnede sig for 82,94% i vildtypen, mens mutanterne udviste følgende procenter: Mut11 (70,29%), Mut7 (67,88%), Mut14 (63,31%) og Mut17 (55,62%). (Figur 8). Det er vigtigt, at disse procenter i høj grad stemmer overens med forekomsten af dsRNA i produkterne (Figur 5). Disse resultater indikerer en signifikant reduktion i terminal transferaseaktivitet af mutanter, som sammen med faldet i RDRP-aktivitet bidrager til faldet i dsRNA.Specifikt kan den terminale transferaseaktivitet spille en mere afgørende rolle, som det fremgår af den laveste akkumulering af n>0 RNA'er observeret i Mut17, som også udviser den laveste dsRNA-produktion (Figur 5 og Figur 8).
Figur 7. Relativ RDRP-aktivitet
Figur 8. Heterogenitet i 3'-enden af RNA-produkter
Konklusion
Denne undersøgelse leverer en robust metode til at identificere mutanter med reduceret dsRNA-indhold og isolerer med succes flere dsRNA-mutanter, der har reduceret RNA-afhængig RNA-polymerase og terminal transferaseaktivitet. Det styrker væsentligt valideringen af sikkerhed og effektivitet, der er integreret i mRNA-terapi, og understreger dets dybe implikationer for fremme af mRNA-vacciner og genterapiapplikationer.
Samtidig har moderselskabet Yeasen har også lanceret et T7 RNAP produkt, der reducerer dsRNA markant tilfreds. Flere partnere har allerede testet de modificerede T7 RNAP-mutanter udviklet af Molefuture og produktet er blevet meget anerkendt af kunderne. Vores kunder mener, at brugen af det nye enzym forenkler oprensningsprocessen af mRNA og reducerer i høj grad immunogeniciteten af IVT produkter, demonstrerer enestående ydeevne i flere anvendelsesscenarier, hvilket beviser dets brede potentielle anvendelse inden for biofarmaceutisk!
Bestillingsinformation
Følgende er repræsentative produkter, der tilbydes af Yeasen. Yderligere størrelser er tilgængelige. Vores produkter er yderst optimeret til at fungere sammen, for at sikre overlegen ydeevne og reproducerbarhed. Vi kan også levere skræddersyede tjenester. Hvis du er interesseret i et produkt, der ikke er vist, så kontakt os, og vi vil arbejde sammen med dig for at opfylde dine behov.