Næste generations sekventering (NGS) har vist ekstremt brede kliniske og videnskabelige forskningsanvendelsesmuligheder inden for områder som patogendetektion, tumormutationsdetektion og reproduktiv genetik på grund af dens høje detektionsfølsomhed, stærke specificitet og evnen til at udføre både kvalitativ og kvantitativ detektion. Bibliotekskonstruktion, som et kernetrin i NGS, påvirker sekventeringskvaliteten direkte. Baseret på retningslinjerne for registreringsgennemgang for in vitro diagnostiske (IVD) produkter, skal forskningsdata for de vigtigste råvarer tilvejebringes. En omfattende analyse og verifikation bør udføres ved at kombinere faktorer såsom de grundlæggende oplysninger, parameterindikatorer og forsyningskilder for råvarerne for at bestemme den bedst egnede kilde til råvarer. Den konventionelle DNA- og RNA-bibliotekskonstruktionsproces omfatter hovedsageligt nøgletrin såsom cDNA-syntese, DNA-fragmentering, adapterligering og bibliotekamplifikation, De forskellige trin indeholder mange typer af råvareenzymer. Screeningen af råvareenzymer forlænger forskningscyklussen. På dette grundlag er omkostningseffektive og enkle bibliotekskonstruktionsmodulprodukter blevet et nyt valg til udvikling af IVD-produkter.
Figur 1. Konventionel DNA-bibliotekskonstruktionsproces (venstre) og RNA-bibliotekskonstruktionsproces (højre), idet Illumina-platformen tages som eksempel
Omvendt transskriptionssyntese er kernedelen af RNA-Seq, Ny type høj effektivitet revers transkriptase, som integrerer flere funktioner såsom høj følsomhed, høj udbytte af cDNA og kompatibilitet med skabeloner af komplekse strukturer er et forskningshotspot. ZymeEditor™ enzymmodifikationsplatformen fra Yeasen har opnået et allround revers transkriptionsprodukt med omfattende forbedret ydeevne gennem retningsbestemt modifikation af M-MLV. Det kan bruges i flere anvendelsesscenarier såsom RNA-seq, enkeltcelle-sekventering, cDNA-kloning og bibliotekskonstruktion.
Figur 2. Ydelse af 13488ES anvendt i RNA-seq
Begrænset af den korte læselængde af sekventeringsplatformen skal DNA fragmenteres tilfældigt før bibliotekskonstruktion. I det tidlige stadie var enzymatisk fragmentering skræmmende på grund af problemer med ensartethed og skævhed. Yeasen Bioteknologi har udviklet to unikke fragmenteringsenzymer, Et kraftigt virkende fragmenteringsenzym, der fungerer ved 37 ℃ i 3-30 minutter og et mildt virkende fragmenteringsenzym, der fungerer ved 30 ℃ i 10-40 minutter. Enzymatiske fragmenteringsprodukter baseret på tilfældig fragmentering forbedrer gradvist deres mangler, De kombineres til modulære produkter til DNA-fragmentering, endereparation og A-tailing, der opfylder de mange krav fra forskellige prøver og forskellige sekventeringstyper.
Figur 3. Fragmenteringseffekter af forskellige DNA-fragmenteringsenzymer: kraftigt virkende fragmenteringsenzym (venstre) og mildt virkende fragmenteringsenzym (højre)
Bibliotekets konverteringsrate er en vigtig indikator for evaluering af bibliotekskvalitet. En høj bibliotekskonverteringsrate betyder til en vis grad bedre biblioteksrigdom og bedre ensartethed af sekventeringsdata. Konventionel T4 DNA-ligase fokuserer på at optimere højeffektiv ligering, men fragmenter er tilbøjelige til selvligering, hvilket reducerer bibliotekets konverteringshastighed og påvirker bibliotekets rigdom og sekventeringskvalitet. Yeasen ZymeEditor™ enzymingeniørplatformen udfører retningsbestemt modifikation på T4 DNA Ligase for at opnå en ny mutant, kombineret med en omhyggeligt optimeret ligeringsbuffer er ligeringsmodulproduktet med høj termisk stabilitet og en lav fragment-selvligeringshastighed blevet udviklet, hvilket væsentligt forbedrer bibliotekets konverteringshastighed.
Figur 4. Termisk stabilitet og linkerrestanalyse af 12996ES
PCR-amplifikationsenzymer er alle nødvendige i NGS-biblioteksfremstillingsmetoder. De fleste high-fidelity DNA-polymeraser har 5'→3'-polymeraseaktivitet og 3'→5'-exonukleaseaktivitet, Det kan syntetisere DNA i 5'→3'-retningen, mens det korrigerer de fejlagtigt inkorporerede baser, Således kan den hurtigt og med høj troskab amplificere DNA-fragmenter. Men få enzymer er specielt designet til NGS, Der er ikke mange biblioteksforstærkningsprodukter, der er effektive, nøjagtige, specifikke og i stand til at amplificere mål af forskellige størrelser og GC-indhold uden bias, og som samtidig har evnen til at præmixe primere på forhånd. Yeasen Biotechnology har udviklet en meget nøjagtig DNA-polymerase med et unikt design og en optimeret hot-start PCR-præmix, den er specielt designet til effektiv, høj-fidelity og lav-bias NGS-biblioteksforstærkning, der løser udfordringerne ved kompleks NGS-biblioteksforstærkning.
Figur 5. Stabilitets- og amplifikationsfejlfrekvensanalyse af 12980ES
Ud over ovenstående serie af NGS-bibliotekskonstruktionsmodulprodukt, Vi leverer også one-stop rå enzymprodukter, at imødekomme forskellige kunders kombinerede behov. Yeasens NGS biblioteks byggeråmaterialeprodukter gennemgår strenge fabrikskvalitetskontrolstandarder, streng batchydelse og stabilitetskvalitetskontrol, så du kan bygge biblioteker uden bekymring.
| Produktkategori | Produktnavn | Kat.nr. | Bemærkning |
| Effektiv cDNA-syntese | Hifair™ Ultra omvendt transkriptase (200 U/μL) | 14604ES | Omvendt transkriptionsenzym |
| Hieff NGS™ ds-cDNA syntesesæt | 13488ES | cDNA syntese modul | |
| DNA Fragmentering & End-Repair & A- Tailing | Hieff™ Smerase | 12907ES | DNA-fragmentase |
| Hieff NGS™ OnePot Pro DNA-fragmenteringsmodul (slutreparation og dA-tailing plus) | 12619ES | DNA Fragmentation & End-Repair & A- Tailing modul | |
| Reparation & A-Tailing | Hieff NGS® Fast-Pace End Repair/dA-Tailing-modul | 12608ES | End-Repair & A- Tailing modul |
| Adapter ligering | 10299ES | T4 DNA ligase | |
| Biblioteksforstærkning | 2× Ultima HF Amplification Mix | 13344ES | High-fidelity enzym |