I high-throughput-sekventering kræver konventionel bibliotekskonstruktion PCR-amplifikation. På den ene side er det at amplificere spor-DNA-prøver og øge bibliotekets udbytte. På den anden side kan den forstærke fluorescerende signaler, hvilket gør det nemmere for sequencere at fange og identificere fluorescerende signaler for at forbedre sekventeringsnøjagtigheden. PCR er dog som et "tveægget sværd". Mens den løser problemet med lavt initial prøvevolumen og amplificerer det fluorescerende signal, introducerer det også amplifikationsfejl og skævheder og kan ikke perfekt præsentere genomsekvensen "True face". Derudover har PCR-polymerase en vis amplifikationsbias. Nogle regioner, især høj GC eller lav GC, sekundær struktur og andre regioner, har lav amplifikationseffektivitet og er svære at dække. Det vil også introducere et stort antal forkerte InDels og bringe et stort antal duplikeringer. , hvilket forårsager spild af DNA-datavolumen og øger omkostningerne ved sekventering. Derfor har introduktionen af ​​PCR-fri teknologi ikke kun fordelene ved PCR, men overvinder også manglerne ved PCR. Det kan ikke kun bringe højkvalitetsbiblioteker med høj følsomhed og realisere påvisningen af ​​sporprøver, men også have høj nøjagtighed og reducere opfølgende valideringsarbejdsbyrde for variantstudier. Så hvad er det PCR-frie bibliotek helt præcist, og hvad er dets fordele?

1. Hvad er PCR-frit bibliotek?
2. Hvad er fordelene ved PCR-fri teknologi?
3. Datavisning af PCR-Free
4. FAQ
5. Produktinformation
6. Vedrørende læsning

1. Hvad er PCR-frit bibliotek?

Næste generations sekventeringsteknologi er den mest almindeligt anvendte teknologi i high-throughput sekventeringsforskning i moderne molekylærbiologi. Traditionel førstegenerationssekventering kan ikke længere fuldt ud opfylde forskernes behov. Genom-resekventering af modelorganismer og genom-sekventering af ikke-modelorganismer kræver flere omkostninger. Lav, højere gennemstrømning, hurtigere sekventeringsteknologi, og dermed født anden generations sekventeringsteknologi. Kerneprincippet i anden generations sekventeringsteknologi er sekventering-ved-syntese, det vil sige at bestemme DNA-sekvensen ved at fange den nyligt syntetiserede endemærkede baseinformation. Hovedprincippet i anden generations sekventeringsteknologi til DNA-sekventering er først at fragmentere DNA'et, reparere enden af ​​det fragmenterede DNA og derefter tilføje specifikke adaptere på begge sider og derefter bruge forskellige metoder til at generere millioner af rumligt fikserede PCR'er. For klonale arrays opnås sekventeringsdata under anvendelse af primerhybridisering og enzymatiske forlængelsesreaktioner for at afbilde de fluorescerende mærker, der er inkorporeret af hver forlængelsesreaktion.

DNA-sekventering ved næste generations sekventering omfatter hovedsageligt to processer: biblioteksforberedelse og on-machine sekventering. Under biblioteksfremstillingen amplificeres tilfældigt afbrudte genomiske fragmenter typisk ved standard PCR. For nogle specielle templates er der imidlertid faktorer såsom kompleks sekundær struktur eller dårlig termisk stabilitet, som påvirker amplifikationspræferencen for template PCR, så ikke alle genomiske sekvenser kan afspejles lige meget i PCR-amplifikationsbiblioteket. Især for nogle skabeloner med højt GC eller højt AT-indhold er det nogle gange vanskeligt at bruge PCR-metoden til at amplificere til bibliotekskonstruktion. Der er ingen forskel mellem det PCR-frie bibliotek og det konventionelle PCR-bibliotek ved sekventering på maskinen, bortset fra at PCR ikke udføres under biblioteksopbygningsprocessen. Det PCR-fri bibliotek kan teoretisk forbedre fordelingen af ​​datalæsninger og generere mere ensartet genomdækning.Det PCR-fri bibliotek er et supplement til bibliotekets opbygningsmetode. Da det er direkte forberedt i et indbygget bibliotek uden PCR-amplifikation, kan det forbedre dækningen af ​​nogle områder med høj GC eller høj AT og derved reducere fejlbaserne introduceret af PCR, databias og sekvensgentagelse.

Kernetrinene i konventionel NGS-bibliotekskonstruktion er genomfragmentering, endereparation, adaptertilsætning, PCR og signalamplifikation før sekventering. Så hvad med PCR-fri bibliotekskonstruktion? Som navnet antyder, er det en biblioteksopbygningsproces, der ikke kræver PCR. Kernetrinene i bibliotekskonstruktion er genomfragmentering, endemodifikation, linkeraddition og bibliotekskvalitetskontrol. Men faktisk kan dette kun betragtes som PCR-frit i bibliotekets byggeproces. Det rigtige PCR-fri burde være en proces fra biblioteksopbygning til sekventering uden biblioteksforstærkning (såsom enkeltmolekyle-sekventeringsteknologi) eller en sekventeringsteknologi uden akkumulering af PCR-amplifikationsfejl (såsom MGI's DNBseq).

Figur 1. Flowdiagram over konventionel bibliotekskonstruktion og PCR-fri bibliotekskonstruktion

2. Hvad er fordelene ved PCR-fri teknologi?

I den rutinemæssige bibliotekskonstruktionsproces kan amplifikationsenzymet introducere fejl. Gennem cyklisk amplifikation vil disse fejl blive akkumuleret og amplificeret, hvilket reducerer troværdigheden af ​​DNA-sekvensreplikation. Derudover har DNA-polymerase også en vis amplifikationsbias, især for regioner med store forskelle i GC-indhold eller sekundære strukturer, hvilket resulterer i lav amplifikationseffektivitet og dårlig dækningsensartethed; samtidig med at man introducerer forkerte InDels, vil det også medføre et stort antal Duplikering forårsager spild af DNA-datavolumen og øger sekventeringsomkostningerne. Den PCR-fri teknologi kan godt undgå de ovennævnte problemer introduceret af PCR-amplifikation i konventionel bibliotekskonstruktion. I processen med bibliotekskonstruktion og sekventering, hvis der er en PCR-amplifikationsproces, vil det have en større indflydelse på ensartetheden af ​​genomdækningen. For DNA-skabeloner har nogle komplekse sekundære strukturer, og nogle har store forskelle i termisk stabilitet. Disse faktorer vil påvirke effektiviteten af ​​PCR-amplifikation. I PCR-amplifikationsprocessen kan det derfor ikke garanteres, at alle genomiske fragmenter kan opnå den samme amplifikationseffektivitet, men der er en åbenlys amplifikationsbias, såsom lav dækning i områder med høj GC eller lav GC af genomet. Der er dog ingen PCR i hele processen med PCR-fri sekventering. Sammenlignet med PCR-bibliotekskonstruktion er dækningen af ​​høje GC-regioner og AT/TA-gentagelsesregioner af genomet forbedret. De specifikke fordele er som følger.

2.1 Strømlinet biblioteksforberedelsesproces, hvilket sparer tid

PCR-fri biblioteksforberedelse eliminerer behovet for PCR-amplifikation og andre trin, hvilket strømliner biblioteksforberedelsesprocessen og sparer tid.

2.2 Reducerede omkostninger til biblioteksforberedelse

I den konventionelle biblioteksfremstillingsproces anvendes dyre high-fidelity-enzymer til PCR-amplifikation for at sikre sekvensægthed. Samtidig eliminerer PCR-Free PCR-amplifikationstrinnet, hvilket reducerer omkostningerne til biblioteksforberedelse.

2.3 Reducer amplifikationsbias

DNA-amplifikationsenzymer har visse amplifikationsbiaser, især for skabeloner med signifikante forskelle i GC-indhold eller sekundær struktur. Derfor kan PCR-Free effektivt undgå amplifikationsbias forårsaget af polymerasen.

2.4 Ingen PCR-duplikation

PCR-Free kan reducere duplikatlæsninger og øge unikke kortlægningshastigheder og effektiv dataudnyttelse.

2.5 Reduceret fejl Pare

PCR-amplifikation er mere tilbøjelig til at introducere replikationsfejl af Insertion & Deletion, hvilket resulterer i en højere fejlrate for Indel-sekventering, mens PCR-Free effektivt kan undgå generering og akkumulering af sådanne fejl.

3. Datavisning af PCR-Free

Hieff NGS™ Ultima Pro PCR Free DNA Library Prep Kit V2 (Cat# 12196ES) har en bedre bibliotekskonverteringsrate end konkurrerende produkter.

Figur 2. Mængde af off-machine sekventeringsdata til PCR-fri bibliotekskonstruktion

4. FAQ

Q: Hvilke typer prøver er velegnede til PCR-fri biblioteker?

A: Nogle prøver med komplekse sekundære strukturer, høj GC og PCR-præference kan vælge et PCR-frit bibliotek at konstruere.

Q: Hvad er den generelle fragmentstørrelse af det PCR-fri bibliotek?

A: Det PCR-fri bibliotek har i sig selv ingen særlige krav til fragmentstørrelsen. PCR-produktbiblioteket, biblioteket er konstrueret i overensstemmelse med størrelsen af ​​PCR-produktet. For det genomiske bibliotek anbefales det at være omkring 350bp, så kvaliteten af ​​biblioteksdataene er relativt god.

5. Produktinformation

Det produkt, som Yeasen kan levere, er vist i tabel 1.

Tabel 1. Produktinformation

6. Vedrørende læsning

Opløsningen til NGS-bibliotekets forberedelse fra DNA-prøver

Hvor meget ved du om NGS-relateret teknologi?