I. Principper for Western Blot
Western Blot (WB), eller proteinimmunoblotting, er en klassisk teknik til at detektere specifikke proteiner baseret på antigen-antistof-interaktioner, som er meget brugt inden for molekylærbiologi, immunologi og relaterede områder. Dens kernetrin omfatter:
- Proteinseparation:
- SDS-PAGE adskiller denaturerede proteiner efter molekylvægt.
- SDS belægger proteiner med en ensartet negativ ladning, hvilket eliminerer strukturelle påvirkninger.
- Membran overførsel:
- Proteiner overføres fra gelen til en membran (f.eks. PVDF eller nitrocellulose).
- Antistofpåvisning:
- Primære antistoffer binder specifikt til målproteinet, efterfulgt af enzymkonjugerede sekundære antistoffer (f.eks. HRP), der genererer et detekterbart signal, såsom kemiluminescens.
II. Standard Western Blot Workflow
| Trin | Nøgleprocedurer | Anbefalede reagenser (Yeasen-produkter) |
| 1. Prøveforberedelse | Ekstraher proteiner med RIPA lysisbuffer; tilsæt PMSF for at hæmme proteaser aktivitet. | RIPA Lysis Buffer Series, PMSF |
| 2. Proteinkvantificering | Brug BCA metode (Kat #20200ES) til kvantificering; match standardfortyndingsbuffer til prøvebuffer. | BCA kvantificeringssæt (Kat #20200ES/20201ES) |
| 3. SDS-PAGE Elektroforese | Brug forstøbte geler, kør ved 150 V, indtil farvestoffet når gelbunden. | Forstøbte geler, SDS-PAGE Loading Buffer |
| 4. Membranoverførsel og blokering | Aktiver PVDF-membran (Kat #36125ES) ved iblødsætning i methanol i 1 min; overførsel ved 300 mA i 60 minutter i et isbad; blokere ved stuetemperatur (RT) i 1 time eller brug hurtig blokeringsopløsning (Kat #36122ES) i 10 min. | Transfer Buffer, PVDF-membranserie |
| 5. Antistofinkubation | Inkuber med primært antistof ved 4°C natten over; sekundært antistof ved stuetemperatur i 1-2 timer; vask med TBST 3x grundigt. | Antistoffortynder |
| 6.Proteinpåvisning | Udvikle med ECL (Kat #36208ES). | ECL Chemiluminescence Series |
Figur 1: Western Blot Workflow
III. Fælles problemer og løsninger
| Spørgsmål | Mulige årsager | Løsninger |
| Høj baggrund  | Ufuldstændig blokering | Brug frisk blokeringsløsning og forlænge blokeringstiden. |
| Utilstrækkelig vask | Øg vaskefrekvensen og -varigheden for at fjerne uspecifik binding. | |
| For høj koncentration af primært antistof | Fortynd antistof til en passende koncentration. | |
| Prøve kvalitetsproblemer | Kontroller prøvens renhed og kvalitet; bruge friske prøver. | |
| Membrantørring | Sørg for, at membranen forbliver hydreret under inkubationstrin; sikre fuld kontakt med reaktionsopløsninger. | |
| Svagt eller intet signal  | Ufuldstændig overførsel | Bekræft overførselseffektiviteten og juster tiden efter behov. |
| Uaktiveret PVDF-membran | Udblød PVDF i methanol for at aktivere før overførsel til buffer. | |
| Primær antistofmismatch med målart | Tjek datablad, sammenlign immunogen- og proteinsekvenser, og medtag en udbredt positiv kontrol (f.eks. β-actin i pattedyrsceller). | |
| Primær og sekundær antistof-inkompatibilitet | Sørg for, at sekundært antistof matcher værtsarten for det primære antistof. | |
| Utilstrækkelig antistofbinding | Forøg antistofkoncentrationen og forlæng inkubationen ved 4°C (f.eks. natten over). | |
| Lave antigenniveauer | Indlæs mindst 20-30 μg protein pr. bane; bruge proteasehæmmere og en positiv kontrol. | |
| Lavt målproteinekspression | Bekræft udtryk i prøve via litteratur/database; koncentrere prøven, eller brug en højekspressionskontrol. | |
| Ikke-specifikke bånd/flere bånd  | Overpasserede cellelinjer ændrer proteinprofiler | Brug lavpassageceller (<15 passager) og kør parallelle kontroller med tidlig passage-aktier. |
| Proteinnedbrydning | Inkluder proteaseinhibitorer i lysisbuffer; Opbevar ved -80°C, undgå fryse-optøning, brug friske prøver. | |
| Post-translationelle modifikationer | Tjek litteraturen for modifikationer, der påvirker båndstørrelsen (f.eks. ubiquitinering, glykosylering). | |
| Flere splejsningsvarianter | Bekræft splejsningsvarianter via litteratur eller databaser. | |
| Proteindimere/multimere | Tilføj frisk β-mercaptoethanol eller DTT til SDS loading buffer. | |
| Eksogen proteinforurening | Tjek for eksogene proteiner; skift cellelinjer om nødvendigt. | |
| Overdreven prøvebelastning | Optimer belastning (20-30 μg) baseret på målekspression via gradienttest. | |
| Multimer dannelse | Kog prøver i 10 minutter for at dissociere multimerer | |
| Høj primær antistofkoncentration | Reducer koncentration og/eller inkubationstid for at undgå ekstra bånd. | |
| Høj sekundær antistofkoncentration | Lavere koncentration og inkludere en sekundær-kun kontrol for at reducere ikke-specifik binding. | |
| Påvisning af urapporterede proteiner eller familiemedlemmer | Gennemgå litteratur eller BLAST; brug anbefalede cellelinjer/væv. | |
| Hvis bekræftet, har du muligvis opdaget et nyt protein! | ||
| Smilende bands  | Hurtig migration, høj buffertemperatur, overbelastning, lav buffer | Langsom migration, forafkøling af buffer, reducer proteinbelastningen, sørg for, at buffer dækker brøndene helt. |
| panderynke bånd  | Enhedsproblemer (f.eks. bobler under gel) | Juster opsætningen for at fjerne bobler og sikre ensartet gelpolymerisation. |
| Halebånd  | Dårlig prøveopløselighed, nedbrydning, genbrugt buffer | Bland prøverne godt, brug friske prøver, klargør frisk kørebuffer. |
| Håndvægt-formede bånd  | Ujævn gel polymerisation, urene prøver | Omstøbt gel for ensartethed; centrifuger prøver før brug. |
| Bånd udtværing  | Overdreven belastning, dårlig gelkvalitet | Reducer prøvevolumen, forbedre gelforberedelsen. |
| Boblemærker  | Luft fanget under overførsel | Fjern bobler, når du samler transfersandwichen. |
| Ujævne sorte pletter  | Uopløst blokerende opløsning, ujævn antistoffordeling | Opløs blokerende opløsning fuldstændigt, vask 3x med TBST, ryst under inkubation. |
| Hvide pletter  | Høj antistofkoncentration udtømmende substrat | Lavere primære/sekundære antistofkoncentrationer. |
Ⅳ.Værktøjer til produktvalg og optimering
Yeasen tilbyder en omfattende suite af reagenser til at strømline din arbejdsgang
Relaterede produkter:
| Procedurer | Kat. Ingen. | Produktnavn | Specifikationer |
| Prøveforberedelse | 20101ES | RIPA lyseringsbuffer (stærk) | 100 ml |
| 20115ES | RIPA lysebuffer (medium) | 100 ml | |
| 20114ES | RIPA lyseringsbuffer (svag) | 100 ml | |
| 20118ES | Lysisbuffer til WB/IP-analyser | 100 ml | |
| BCA Protein Quantification Kit (forbedret) | 500 T/2500 T/5000 T | ||
| BCA Protein Quantification Kit (Klar til brug) | 500 T | ||
| SDS-SIDE Elektroforese | Gold Band Plus 3-farvet Regular Range Protein Marker (8-180 kDa) | 250 μL/2×250 μL/10×250 μL | |
| GoldBand™ 3-farve High Range Protein Marker (10-245 KDa) | 2×250 μL/10×250 μL | ||
| 20328ES | SDS-PAGE Gelforberedelseskit | 1 sæt (30~50 geler)/ 1 sæt (150~250 geler) | |
| SIDE Gel Quick Preparation Kit | Koncentrationer: 8 %, 10 %, 12,5 %, 15 % | ||
| 36259ES-36280ES | Precast Protein Plus Gel | Koncentrationer: 8%, 10%, 12%, 4-12%, 4-20% Indstillinger for indlæsning af brønd: 10 brønde, 12 brønde, 15 brønde | |
|
Membranoverførsel og blokering | 0,45 μm PVDF-membran (1 rulle, 30 cm×3 m) | 1 rulle | |
| 0,22 μm PVDF-membran (1 rulle, 30 cm×3 m) | 1 rulle | ||
| Antistofinkubation | 36206ES | Primær og sekundær antistoffortynder til WB | 100 ml/500 ml |
|
Proteinpåvisning | Super ECL-detektionsreagens | 100 ml/500 ml | |
| Forbedret ECL kemiluminescerende substratsæt | 100 ml/500 ml |
V.Sådan får du support
Til personlig fejlfinding eller protokoloptimering:
- Besøg: Yeasen Western Blot produktside
- E-mail: info@yeasenbio.com
Gylden regel for succes: Standardiserede procedurer + reagenser af høj kvalitet + trin-for-trin validering = reproducerbare WB-resultater!