Hieff^™ Hurtig celle direkte RT-qPCR Kit baseret på SYBR Grønt farvestof er velegnet til RNA-ekstraktion fra alle slags dyreceller (såsom celleafstamningsvægceller og suspensionsceller, primære kulturceller, forskellige stamceller, iPS-celler osv.), uden behov for at ekstrahere RNA, og kan bruges direkte til qPCR-ekspressionsanalyse, som er kort, nem at betjene og har en lav fejlrate. Det tager kun 1,5 time at fuldføre trinene fra skabelonforberedelse til omvendt transkriptionsreaktion og genekspressionsanalyse.

Omvendt transkriptions- og fluorescensdetektionsreagenser er inkluderet i sættet, som kan bruges til genekspressionsanalyse uden behov for at købe yderligere reagenser.

Specifikationer

Komponenter

Opbevaring

FCD Lysis Buffer og FCD Washing Buffer blev smeltet og opbevaret ved 4°C for at forhindre kontaminering. FCD Stop Solution、DNase I、4× Hifair™ FCD RT Mix、2× Hieff™ FCD qPCR SYBR Master Mix skal opbevares ved -25~-15℃.

Instruktioner

1. Tilberedning af spaltningsprodukter

1)1. Smelt reagenset ved stuetemperatur, vend det på hovedet og bland det forsigtigt inden brug, og brug det efter let centrifugering for at undgå skumdannelse*.

*Manglende blanding af reagenserne, brug af en oscillator til blanding og manglende konfiguration af reagenserne på is kan føre til et fald i reaktionens ydeevne.

2) Afhængigt af celletypen** overføres cellerne til et centrifugerør og centrifugeres ved 5000 rpm i 2 minutter for at opsamle cellerne og aspirere mediet godt. Hvis cellerne dyrkes i plader med 96 brønde, kan mediet aspireres direkte.

​​​​3) Tilsæt 150 μL FCD-vaskebuffer til hver brønd, vask cellerne ved at blæse, centrifuger ved 5000 rpm i 2 minutter, og aspirér FCD-vaskebufferen***.

​​​​4) Tilsæt 48 μL FCD-lysisbufferopløsning og 2 μL DNase Ⅰ-opløsning til hver brønd, blæs og bland ved stuetemperatur, lad det stå i 5 minutter, og tilsæt derefter 2.5 μL FCD stopopløsning efter inkubation****, og blæs og bland derefter ca. 5 gange for at opnå spaltningsproduktet*****.

** Det grundlæggende krav til antallet af celler er 1 × 10⁴ celler pr. brønd, og dette sæt kan bruges i området 1 × 10³ - 1 × 10⁶ celler. hvis antallet af celler er større, kan mængden af ​​FCD Lysis Buffer-opløsning og DNaseⅠ-opløsning øges proportionalt efter behov.

*** Centrifugeringsbetingelserne varierer fra celle til celle, så centrifuger venligst med en hastighed, der passer til de celler, der bruges.

**** Tilføj 2,5 μL FCD-stopopløsning til 50 μL lysat, og øg mængden af ​​FCD-stopopløsning efter behov.

***** Til langtidsopbevaring af cellelyseproduktopløsninger, placeres ved -20°C.

5）Smelt 4 x Hifair™ FCD RT Bland ved stuetemperatur og bland med let vending, anbring på is og konfigurer reaktionssystemet i henhold til nedenstående tabel:

*******Anbefalet brugsniveau er 2-5 μL, prøv ikke at overstige 45 %.

1. Omvendt transskription

Pipetter og bland forsigtigt ovenstående tilberedte reaktionsopløsning, og udfør omvendt transkriptionsreaktion i henhold til proceduren i nedenstående tabel:

* Den anbefalede temperatur for omvendt transskription er 55°C. For skabeloner med højt GC-indhold eller komplekse skabeloner kan revers transkriptionstemperaturen øges til 60°C. Det omvendte transkriptionsprodukt kan bruges direkte til nedstrøms RT-qPCR-detektion. For at undgå inhibering af qPCR-reaktion af det omvendte transkriptionssystem og for at få den passende Ct-værdi (10-35), kan produktet fortyndes 10-1000 gange og derefter bruges. Hvis nedstrømsforsøg ikke udføres i kort tid, den kan placeres ved -20 ℃ til opbevaring.

1. Fluorescens kvantitativ PCR

1） Reaktion system konfiguration

Følgende forhold anbefales til fremstilling af reaktionsopløsningen (fremstilling på is).

*Tilsæt ikke mere end 1/10 af RT-qPCR-volumenet af revers transkriptionsproduktet. høj koncentration af skabelon vil let føre til uspecifik amplifikation, passende fortynding på 5-50 gange. Den anbefalede mængde skabelon er 4 μL, prøv ikke at overstige 6 μL. Når reaktionsevnen er dårlig, kan primerkoncentrationen justeres i området 0,2-1,0 μmol/L.

2）Fluorescens kvantitativ PCR-amplifikationsprocedure (to-trins metode)

3） Hurtig amplifikationsprocedure for fluorescerende kvantitativ PCR (to-trins metode)

* Udglødnings-/forlængelsetemperaturen og den endelige forlængelsestid kan justeres passende i henhold til de eksperimentelle krav. Det hurtige program er velegnet til de fleste gener, og standardprogrammet kan afprøves for individuelle komplekse sekundære strukturgener.

Noter

1. Dette produkt er kun til forskningsbrug.
2. Brug venligst laboratoriefrakker og engangshandsker, for din sikkerhed.

Ver.EN20230908

Dokumenter:

Manualer

11172-Hieff™ Fast Cell Direct. EN20230908.pdf