Hieff NGS® DNA&RNA Library Co-Prep Kit V2 er et DNA&RNA-sambibliotekskit til Illumina®&MGI®-sekventeringsplatform, som indeholder effektivt cDNA-syntesereagens og enzymfordøjelsesreagens. Sammenlignet med det traditionelle bibliotek konstruktion metode, kan dette produkt effektivt fuldføre cDNA-syntese og DNA & RNA-bibliotek konstruktion i ét rør. Sættet indeholder højkvalitetsenzym til DNA-fragmentering og kombinerer DNA-fragmentering, endereparation og dA-tailing i ét trin, hvilket reducerer tid og omkostninger til biblioteksforberedelse betydeligt. Dette biblioteksforberedelseskit har en fremragende bibliotekskonverteringsrate og kan anvendes til prøver fra alle almindelige dyr, planter, mikroorganismer osv., og også FFPE-prøverne. Dette opgraderede sæt, der bruger den seneste optimerede ligase, reducerer i høj grad selvligeringshastigheden under adapterligering. Desuden forbedrer introduktionen af ​​en ny high-fidelity polymerase yderligere homogeniteten og pålideligheden af ​​amplifikation.

Alle de komponenter, der leveres af sættet, har gennemgået streng kvalitetskontrol og funktionskontrol, hvilket sikrer stabiliteten og repeterbarheden af ​​bibliotekskonstruktionen i størst muligt omfang.

Specifikationer

Komponenter

Note: * angiver, at dette reagens ikke er inkluderet i dette kit, og at der kræves yderligere reagenser. Sættet er kompatibel med to platforme af Illumina^®&MGI^®, men yderligere primerblanding (CAT # 13334 Primer Mix for MGI^® og Cat# 13335 Primer Mix til Illumina^®) er påkrævet.

Arbejdsflow:

Opbevaring

Dette produkt skal opbevares ved -25~-15 ℃ til 1 år.

Noter

Om operationen

1. 1. Betjen venligst med laboratoriefrakker og engangshandsker, for din sikkerhed.
2. Tø komponenterne op ved stuetemperatur.Efter optøning blandes grundigt ved vortexing, drej røret kort og læg dem på is til senere brug.
3. Det anbefales at udføre hvert reaktionstrin i en termocykler med opvarmet låg. Termocykleren skal forvarmes til den indstillede temperatur før brug.
4. Brug venligst forbrugsstoffer uden RNaseforurening., og rengøring af forsøgsområdet regelmæssigt. ThermoFishers RNAZap^TM højeffektiv nukleinsyrefjernelsesspray blev anbefalet til at fjerne RNase-kontamination.
5. Ukorrekt betjening kan højst sandsynligt forårsage aerosolforurening, hvilket påvirker resultatets nøjagtighed.Obligatorisk fysisk isolering af PCR-reaktionsblandingsregioner og PCR-produktoprensningsassayregioner anbefales. Udstyret med udstyr såsom specialiserede pipetter til biblioteksbyggeri.
6. 6. Dette produkt er kun til forskningsbrug.

Adapter Ligation

1. Illumina eller MGI Long Adapter (Barcoded Adapter)-sæt og korte Adapter-sæt er tilgængelige for kunderne at vælge i henhold til deres eksperimentelle krav.
2. Det blev anbefalet at vælge kommercielle adaptere af høj kvalitet. Hvis selvfremstillede adaptere vælges, bedes du overlade en virksomhed med erfaring i NGS-primersyntese og bemærke behovet for streng kontamineringskontrol. Derudover anbefales det at forberede DNA-annealing-opløsningen på en ren bænk og kun betjene én type adapter hver gang for at forhindre krydskontaminering.
3. Optø venligst adapterne på isen eller ved 4°C; ved stuetemperatur bør laboratorietemperaturen ikke overstige 25°C for at forhindre adapterne i at denaturere.
4. Koncentrationen af ​​adapteren påvirker direkte ligeringseffektiviteten og biblioteksudbyttet. Adaptervolumen tilføjet til sættet er fastsat til 5 μl. Adapterne anbefales at fortyndes med 0,1×TE buffer, og de fortyndede adaptere kan opbevares ved 4°C i 48 timer. Tabel1 viser den anbefalede adaptermængde for forskellige mængder input-RNA.

Tabel 1-1 Den anbefalede Illumina^® adaptermængde for forskelligt input DNA og RNA

Tabel 1-2 Den anbefalede MGI^® adaptermængde for forskelligt input DNA og RNA

*Anvendelsen af ​​adapteren kan justeres i henhold til forskellige typer af Total RNA-prøver og inputmængde.

Biblioteksforstærkning

Amplifikationscyklusnumre bør kontrolleres strengt. Utilstrækkelig amplifikation kan føre til lavt biblioteksudbytte; Overamplifikation kan introducere øget bias, fejl, duplikeret læsning og kimære produkter. Tabel 2 viser anbefalede cyklusnumre, der er målrettet biblioteksudbyttet på 1 μg.

Tabel 2 Det anbefalede antal cyklusser til at generere DNA- og RNA-bibliotek *

Bemærk:*Bibliotekets udbytte er ikke kun relateret til inputmængden og antallet af amplifikationscyklusser, men påvirkes også af kvaliteten af ​​prøver, fragmenteringsbetingelser og sorteringsbetingelser. I processen med bibliotekskonstruktion skal du vælge de mest passende forhold i henhold til den faktiske situation.

Perlebaseret DNA-oprydning og størrelsesvalg

1. 1.Der er flere trin i biblioteksopbygningsprocessen, der kræver DNA-oprensning magnetiske perler. Vi anbefaler Hieff NGS™ DNA-selektionsperler (Yeasen Cat#12601) eller AMPure® XP magnetiske perler (Beckman Cat#A63880) til DNA-oprensning og størrelsesvalg.
2. 2. De magnetiske perler skal ækvilibreres ved stuetemperatur før brug, ellers vil udbyttet falde, og størrelsesvalgseffekten vil blive påvirket.
3. 3. De magnetiske perler skal blandes godt ved vortex eller pipettering før brug.
4. 4.Sug ikke perlerne, når supernatanten overføres, selv spormængder af perlerne kan påvirke følgende reaktioner.
5. 5. 80 % ethanol skal være frisklavet, ellers vil det påvirke genvindingseffektiviteten.
6. 6. De magnetiske perler skal tørres ved stuetemperatur før eluering af produktet. Utilstrækkelig tørhed vil let få rester af ethanol til at påvirke efterfølgende reaktioner; overdreven tørhed vil få de magnetiske perler til at revne og reducere rensningsudbyttet. Normalt er tørring ved stuetemperatur i 3-5 minutter nok til at lade perlerne tørre helt.
7. 7. Om nødvendigt eluerede de oprensede eller størrelsesudvalgte DNA-prøver ind1× TE-buffer kan opbevares ved 4°C i 1-2 uger eller ved -20°C i en måned.

Bibliotekskvalitetsanalyse

1. Kvaliteten af ​​de konstruerede biblioteker analyseres generelt ved at måle koncentrationer og størrelsesfordelinger.
2. Bibliotekernes koncentrationer kan måles ved hjælp af fluorescensbaserede metoder såsom Qubit og PicoGreen eller qPCR.
3. Det anbefales IKKE at bruge absorbansbaserede kvantificeringsmetoder såsom NanoDrop.
4. Det anbefales at bruge qPCR-metoden til bibliotekskvantificering: fluorescensbaserede metoder såsom Qubit og PicoGreen kan ikke differentiere de ufuldstændige dsDNA-strukturer (inserts uden adapter eller med kun en af ​​enderne ligeret med adapter) fra de komplette biblioteker. qPCR-metoden vil kun amplificere og måle de komplette biblioteker med begge ender ligeret med adaptere (de sekventerbare biblioteker), hvilket giver en mere nøjagtig måling til indlæsning.
5. Størrelsesfordelingen af ​​biblioteker kan analyseres ved hjælp af Agilent Bioanalyzer eller andre enheder baseret på principperne for kapillær elektroforese eller mikrofluidik.

Andre materialer

1. 1. Magnetiske perler til DNA-oprensning: Hieff NGS™ DNA-selektionsperler (Yeasen Cat#12601) eller AMPure^®XP Beads (A63880) eller andre tilsvarende produkter.

2.Adaptere: Komplet Adapter til Illumina (Yeasen Cat#13519-13520 eller andre tilsvarende produkter) eller Komplet Adapter til MGI (Yeasen Cat#13360-13362 eller andre tilsvarende produkter).

3. Bibliotekskvalitetsanalyse: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip eller andre tilsvarende produkter; bibliotekets kvantitative reagenser.
4. Andre materialer: absolut ethanol, sterilt ultrarent vand, pipettespidser med lav retention, PCR-rør, magnetiske stativer, termocykler osv.

Dokumenter:

Manualer

12305ES-Hieff NGS® DNA&RNA Library Co-Prep Kit V2.pdf