Beskrivelse
Produktbeskrivelse
Hieff NGS™ Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit er et samlet RNA-sekventeringsbiblioteksbyggesæt til Illumina®- og MGI®-sekventeringsplatformen, inklusive RNA-fragmenteringsreagenser, revers transkriptionsreagenser, konventionelle og strengspecifikke ds-cDNA-syntesereagenser og biblioteksforstærkningsreagenser. Sekvenseringsbiblioteket kan konstrueres efterfulgt af mRNA-oprensningskittet eller rRNA-fjernelseskittet. To-strengs syntesemodulet er udstyret med to buffere for at imødekomme behovet for et konventionelt bibliotek eller strengspecifikt bibliotek. Blandt dem er dTTP erstattet med dUTP i den strengspecifikke to-strengs syntesebuffer, så dUTP kan tilføjes til den anden streng af cDNA. Den high-fidelity DNA-polymerase, der anvendes i dette kit, kan ikke amplificere DNA-skabelonen, der indeholder uracil, og opnå strengspecificitet. Alle leverede reagenser har gennemgået streng kvalitetskontrol og funktionel verifikation, hvilket sikrer stabiliteten og reproducerbarheden af bibliotekskonstruktionen i størst muligt omfang.
Arbejdsflow
Produktkomponenter
| Komponenter | 12308ES24 | 12308ES96 | |||
| 12308-A | 2× Frag/Prime Buffer | 250 μL | 930 μL | ||
| 12308-B | 1st Strand Enzyme Mix | 48 μL | 192 μL | ||
| 12308-C | Strandspecificitetsreagens | 150 μL | 580 μL | ||
| 12308-D | 2. Strandbuffer (dNTP) | 720 μL | 2×1440 μL | ||
| 12308-E | 2. Strandbuffer (dUTP) | 720 μL | 2×1440 μL | ||
| 12308-F | 2. Strand Enzyme Master Mix | 120 μL | 480 μL | ||
| 12308-G | Ligation Enhancer | 720 μL | 2×1440 μL | ||
| 12308-H | Ny T4 DNA Ligase | 120 μL | 480 μL | ||
| 12308-I | 2×Super Canace® II High-Fidelity Mix | 600 μL | 2×1200 μL | ||
| 12308-K | Nukleasefri H2O | 300 μL | 1000 μL | ||
Bemærk: Dette sæt er kompatibelt med både Illumina- og MGI-platforme, men yderligere Illumina eller MGI Primer Mix ( Cat # 13335 Primer Mix til Illumina og Cat# 13334 Primer Mix til MGI ) er påkrævet.
Forsendelse og opbevaring
Hieff NGS™ Ultima Dual-mode mRNA Library Prep Kit-komponenterne i Box I leveres med isposer og kan opbevares ved 2-8°C i et år.
Hieff NGS™ Ultima Dual-mode mRNA Library Prep Kit-komponenterne i Box II sendes med tøris og kan opbevares ved -20°C i et år.
Forsigtig
1 Betjening
1.1 For din sikkerhed og sundhed skal du bære personlige værnemidler (PPE), såsom laboratoriefrakker og engangshandsker, når du arbejder med dette produkt. Dette produkt er KUN til forskningsbrug!
1.2 Tø komponenter op ved stuetemperatur. Bland grundigt ved at vende op og ned flere gange, centrifugere kortvarigt og læg på is til brug.
1.3 Det anbefales at udføre hvert trins reaktion i en termocykler med et opvarmet låg. Termocykleren skal forvarmes til den indstillede temperatur før brug.
1.4 Forsyning fri for RNase-kontamination og rengøring af forsøgsområdet regelmæssigt er nødvendigt.
1.5 Forkert betjening kan højst sandsynligt forårsage aerosolforurening, hvilket påvirker resultatets nøjagtighed. Obligatorisk fysisk isolering af PCR-reaktionsblandingsregioner og PCR-produktoprensningsassayregioner anbefales. Udstyret med udstyr såsom specialiserede pipetter til biblioteksbyggeri.
2 Adapter Ligation
2.1 Illumina eller MGI Long Adapter (Barcoded Adapter) kits og korte Adapter kits er tilgængelige for kunderne at vælge imellem i henhold til deres eksperimentelle krav.
2.2 Det blev anbefalet at vælge kommercielle adaptere af høj kvalitet. Hvis selvfremstillede adaptere vælges, bedes du overlade en virksomhed med erfaring i NGS-primersyntese og bemærke behovet for streng kontamineringskontrol. Derudover anbefales det at forberede DNA-annealing-opløsningen på en ren bænk og kun betjene én type adapter hver gang for at forhindre krydskontaminering.
2.3 Optø venligst adapterne på isen eller ved 4°C; ved stuetemperatur bør laboratorietemperaturen ikke overstige 25°C for at forhindre adapterne i at denaturere.
2.4 Koncentrationen af adapteren påvirker direkte ligeringseffektiviteten og biblioteksudbyttet. Adaptervolumen tilføjet til sættet er fastsat til 5 μl. Adapterne anbefales at fortyndes med 0,1×TE buffer, og de fortyndede adaptere kan opbevares ved 4°C i 48 timer. Tabel 1 viser den anbefalede adaptermængde for forskellige mængder input-RNA.
Tabel 1-1 Den anbefalede Illumina-adaptermængde for forskelligt input-RNA
| Input total RNA | Illumina Adapter lagerkoncentration |
| 10 ng | 1 μM |
| 100 ng | 1,5 μM |
| 500 ng | 3 μM |
| ≥1 μg | 5 μM |
Tabel 1-2 Den anbefalede MGI®-adaptermængde for forskelligt input-RNA
| Input total RNA | MGI Adapter lagerkoncentration |
| 100-499 ng | 2 μM |
| 500-4000 ng | 5 μM |
*Anvendelsen af adapteren kan justeres i henhold til forskellige typer af Total RNA-prøver og inputmængde.
3 Biblioteksforstærkning
3.1 På basis af den første generation af DNA-polymerase har high-fidelity-DNA-polymerasen i sættet i høj grad forbedret sin amplifikationsensartethed og udviser ingen amplifikationsbias.
3.2 Hvis indekseret adapter (også kendt som en lang adapter eller stor Y-adapter) ligeres til mål-DNA'et, kan primerblandingen i dette kit bruges til amplifikation; hvis en "kort adapter" eller "lille Y-adapter" bruges til DNA-ligering, er indeksprimere nødvendige til amplifikation.
3.3 Amplifikationscyklusnumre bør kontrolleres nøje. Utilstrækkelig amplifikation kan føre til lavt biblioteksudbytte; Overamplifikation kan introducere øget bias, fejl, duplikeret læsning, kimære produkter og akkumulering af ekspansionsmutationer. Tabel 2 viser de anbefalede cyklusnumre for PCR-amplifikation.
Tabel 2 Det anbefalede antal cyklusser til at generere RNA-bibliotek*
| Input total RNA | Antal cyklusser | |
| Ikke-strandet | Strandet | |
| 10 ng | 15 | 15 |
| 100 ng | 14 | 14 |
| 500 ng | 12 | 13 |
| 1 μg | 11 | 12 |
Bemærk:*Bibliotekets udbytte er ikke kun relateret til inputmængden og antallet af forstærkningscyklusser men også påvirket af kvaliteten af prøver, fragmenteringsforhold og sorteringsforhold. I processen med bibliotekskonstruktion skal du vælge de mest passende forhold i henhold til den faktiske situation.
4 Perlebaseret DNA-oprydning og størrelsesvalg
4.1 Der er flere trin i biblioteksopbygningsprocessen, der kræver DNA-oprensningsmagnetiske perler. Vi anbefaler Hieff NGS™ DNA-selektionsperler (Yeasen Cat#12601) eller AMPure® XP magnetiske perler (Beckman Cat#A63880) til DNA-oprensning og størrelsesvalg.
4.2 De magnetiske perler skal ækvilibreres ved stuetemperatur før brug, ellers vil udbyttet falde, og den størrelsesudvælgende effekt vil blive påvirket.
4.3 De magnetiske perler skal blandes godt ved vortex eller pipettering før brug.
4.4 Aspirer ikke perlerne, når supernatanten overføres, selv spormængder af perlerne kan påvirke følgende reaktioner.
4.5 De 80 % ethanol skal være frisklavet, ellers vil det påvirke genvindingseffektiviteten.
4.6 De magnetiske perler skal tørres ved stuetemperatur før eluering af produktet. Utilstrækkelig tørhed vil let få rester af ethanol til at påvirke efterfølgende reaktioner; overdreven tørhed vil få de magnetiske perler til at revne og reducere rensningsudbyttet. Normalt er tørring ved stuetemperatur i 3-5 minutter nok til at lade perlerne tørre helt.
4.7 Om nødvendigt kan de oprensede eller størrelsesvalgte DNA-prøver elueret i TE-buffer opbevares ved 4°C i 1-2 uger eller ved -20°C i en måned.
5 Bibliotekskvalitetsanalyse
5.1 Normalt kan kvaliteten af det konstruerede bibliotek evalueres ved længdefordeling og koncentrationsdetektion.
5.2 Detektion af bibliotekskoncentration: metoder baseret på dobbeltstrengede DNA-fluorescerende farvestoffer, såsom Qubit®, PicoGreen®, etc.; absolut kvantificering baseret på qPCR.
5.3 Metoder baseret på spektral detektion, såsom NanoDrop® osv., er ikke anvendelige til påvisning af bibliotekskoncentration.
5.4 qPCR anbefales til påvisning af bibliotekskoncentration: Gennem Qubit®, PicoGreen® og andre metoder baseret på dobbeltstrengede DNA-fluorescerende farvestoffer kan den ikke effektivt skelne mellem produkter ligeret til adaptere i den ene ende, produkter, der ikke er ligeret til adaptere i begge ender, og andre ufuldstændige dobbeltstrengede produkter. Absolut kvantificering af qPCR er baseret på princippet om PCR-amplifikation, som kun kvantificerer det komplette bibliotek af adapteren i begge ender af prøven (biblioteket, der kan sekventeres), med undtagelse af interferensen af ikke-sekventerende biblioteker, der ikke ligeres til adapteren i enten enkelt-ende eller dobbelt-endede ender.
5.5 Detektion af bibliotekslængdefordeling kan udføres af Agilent Bioanalyzer 2100 og andet udstyr baseret på princippet om kapillær elektroforese eller mikrofluidik.
Dokumenter:
12308ES-Hieff NGS™ Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit-Ver.EN20230327.pdf
Citater og referencer:
[1] Dechifrering af tarmmikrobiomet af græskarper gennem multi-omics tilgang
M Li, H Liang, H Yang, Q Ding, R Xia, J Chen, W Zhou… - Microbiome, 2024 IF:19.4
[2] Pooled CRISPR-screening identificerer P-legemer som repressorer af kræft epitel-mesenkymal overgang
L Fang, L Zhang, M Wang, Y He, J Yang, Z Huang… - Kræftforskning, 2024 IF:12.7
[3] Klotho-afledt peptid 1 hæmmer cellulær senescens i den fibrotiske nyre ved at genoprette Klotho-ekspression via posttranskriptionel regulering
X Zhang, L Li, H Tan, X Hong, Q Yuan, FF Hou… - Theranostics, 2024 IF:12.4
[4] Eksoskelet delvist coatede stamceller til genoprettelse af infarkt myokardium
H He, Y Yuan, Y Wu, J Lu, X Yang, K Lu… - Avancerede materialer, 2023 IF: 29.4
[5] Genomisk innovation og regulatorisk omledning under udviklingen af bomuldsslægten Gossypium
M Wang, J Li, Z Qi, Y Long, L Pei, X Huang… - Nature Genetics, 2022 IF:41.379
[6] MTMR3-risikoalleler forbedrer Toll Like Receptor 9-induceret IgA-immunitet ved IgA-nefropati
Y Wang, T Gan, S Qu, L Xu, Y Hu, L Liu, S Shi, J Lv… - Kidney International, 2023 IF:19.6
[7] Opdelt komplementering af basiseditorer for at minimere redigeringer uden for målet
X Xiong, K Liu, Z Li, FN Xia, XM Ruan, X He, JF Li - Nature Plants, 2023 IF:18.6
[8] Konstruerede bakterielle ydre membranvesikler, der indkapsler onkolytiske adenovira, øger effektiviteten af cancerviroterapi ved at øge tumorcelleautofagi
W Ban, M Sun, H Huang, W Huang, S Pan… - Nature Communications, 2023 IF:16.6
[9] Cancercellemodstand mod IFNγ kan opstå via forbedret dobbeltstrenget brudreparationsaktivitet
T Han, X Wang, S Shi, W Zhang, J Wang, Q Wu… - Cancer Immunology Research, 2023 IF: 12.0
[10] Kombinationsterapi baseret på dual-target biomimetisk nano-leveringssystem til at overvinde cisplatinresistens i hepatocellulært karcinom
Y Huang, Q Kou, Y Su, L Lu, X Li, H Jiang… - Journal of Nanobiotechnology, 2023 IF: 10.9
[11] PIAS3 fremmer ferroptose ved at regulere TXNIP via TGF-β signalvej i hepatocellulært karcinom
W Bao, J Wang, K Fan, Y Gao, J Chen - Farmakologisk forskning, 2023 IF:9.3
[12] Identifikation af RNA-bindende proteinmål med HyperTRIBE i Saccharomyces cerevisiae
W Piao, C Li, P Sun, M Yang, Y Ding, W Song… - International Journal of Molecular Science, 2023 IF:5.6
[13] Mikrobiota regulerer livscyklusovergang og nematocytdynamik hos vandmænd
S Peng, L Ye, Y Li, F Wang, T Sun, L Wang, W Hao… - Iscience, 2023 IF: 5.08
[14] Transkriptom- og miRNA-profiler afslører regulatorisk netværk og nøgleregulatorer for sekundær Xylem-dannelse i "84K" poppel
H Wang, P Zhao, Y He, Y Su, X Zhou… - International Journal of Molecular Science, 2023 IF:5.6
Betaling og sikkerhed
Dine betalingsoplysninger behandles sikkert. Vi gemmer ikke kreditkortoplysninger og har heller ikke adgang til dine kreditkortoplysninger.
Forespørgsel
Du kan også lide
FAQ
Produktet er kun til forskningsformål og er ikke beregnet til terapeutisk eller diagnostisk brug hos mennesker eller dyr. Produkter og indhold er beskyttet af patenter, varemærker og ophavsrettigheder ejet af Yeasen Biotechnology. Varemærkesymboler angiver oprindelseslandet, ikke nødvendigvis registrering i alle regioner.
Visse applikationer kan kræve yderligere tredjeparts intellektuelle ejendomsrettigheder.
Yeasen er dedikeret til etisk videnskab og mener, at vores forskning bør adressere kritiske spørgsmål og samtidig sikre sikkerhed og etiske standarder.