Hieff NGS^TM EvoMax RNA Library Prep Kit (dUTP) er en færdigblandet, actinomycin D gratis og strengspecifik total RNA-sekventeringsbibliotek forberedelse kit, der er kompatibelt med Illumina- og MGI-platforme. Dette produkt fås i to typer: rør eller tætningssæt, og dette sæt er mere bekvem enten ved automatiseret væskehåndteringsenhed eller manuel manipulation . Sættet indeholder RNA-fragmenteringsreagenser, revers transkriptionsreagenser, strengspecifikke ds-cDNA-syntesereagenser og biblioteksforstærkningsreagenser. Det kan forbindes med mRNA-oprensningskittet eller rRNA-fjernelsessættet til lave mRNA- eller lncRNA-forskning. Dette produkt optimerer revers transkriptionsmodulet for at opnå et højkædespecificitetsbibliotek uden actinomycin D, hvilket i højere grad sikrer forsøgsledernes sikkerhed. Alle reagenser blev udsat for streng kvalitetskontrol og funktionel validering for at maksimere stabiliteten og repeterbarheden af ​​biblioteket forberedelse.

Specifikationer

Komponenter

Bemærk: * Notationen angiver, at komponenten ikke er inkluderet i sættet. Primerblanding er påkrævet, hvis de komplette adaptere bruges, ellers er det ikke't. Dette sæt er kompatibelt med Illumina- og MGI-platforme, men har brug for yderligere primerblanding (Kat. # 13334 Primer Mix til MGI^TM og Cat # 13335 Primer Mix for Illumina®) til Illumina® eller MGI platform, hvis de komplette adaptere bruges.

Figur

Layoutet af pladereagensgruppen.

Figur 1: Reagenslayout af forseglingspladebibliotekskit

Figur 2. Forenklede komponenter af EvoMax RNA Library Prep Kit.

Opbevaring

Dette produkt skal opbevares ved -25~-15 ℃ til 1 år.

Instruktioner

1. Den anbefalede mængde at tilføje i et 20 μL system er 0,1-1 enheder (U), og inputmængden kan justeres baseret på de faktiske resultater.

2. I henhold til eksperimentets krav kan den endelige koncentration af dUTP justeres mellem 0,2 ~ 0,6 mM, og 0,2 mM dTTP kan tilsættes selektivt.

3. Reaktionstiden ved 25~37℃ kan justeres inden for 5 ~ 10 minutter i henhold til det eksperimentelle behov.

Noter

1. Operation

1) Arbejd venligst med laboratoriefrakker og engangshandsker，for din sikkerhed.

2) Tø komponenterne op ved stuetemperatur. Bland grundigt ved at vende op og ned flere gange, centrifugere kortvarigt og læg på is til brug.

3) Det anbefales at udføre hvert trins reaktion i en termocykler med et opvarmet låg. Termocykleren skal forvarmes til den indstillede temperatur før brug.

4) Forsyning fri for RNase-kontamination og rengøring af forsøgsområdet regelmæssigt er nødvendigt. ThermoFishers RNAZap^TM højeffektiv nukleinsyrefjernelsesspray blev anbefalet til at fjerne RNase-kontamination.

5) Ukorrekt betjening kan højst sandsynligt forårsage aerosolforurening, hvilket påvirker resultatets nøjagtighed. Obligatorisk fysisk isolering af PCR-reaktionsblandingsregioner og PCR-produktoprensningsassayregioner anbefales. Udstyret med udstyr såsom specialiserede pipetter til biblioteksbyggeri.

6) Dette reagens er til engangsbrug. Flergangsbrug er strengt forbudt.

7) Dette produkt er kun til forskningsbrug.

2. Adapter Ligation

1) Illumina eller MGI Long Adapter (Barcoded Adapter)-sæt og korte Adapter-sæt er tilgængelige for kunderne at vælge i henhold til deres eksperimentelle krav.

2) Det blev anbefalet at vælge kommercielle adaptere af høj kvalitet. Hvis selvfremstillede adaptere vælges, bedes du overlade en virksomhed med erfaring i NGS-primersyntese og bemærke behovet for streng kontamineringskontrol. Derudover anbefales det at forberede DNA-annealing-opløsningen på en ren bænk og kun betjene én type adapter hver gang for at forhindre krydskontaminering.

3) Optø venligst adapterne på isen eller ved 4°C; ved stuetemperatur bør laboratorietemperaturen ikke overstige 25°C for at forhindre adapterne i at denaturere.

4) Koncentrationen af ​​adapteren påvirker direkte ligeringseffektiviteten og biblioteksudbyttet. Adaptervolumen tilføjet til sættet er fastsat til 5 μl. Adapterne anbefales at fortyndes med 0,1×TE buffer, og de fortyndede adaptere kan opbevares ved 4°C i 48 timer. Tabel 1 viser den anbefalede adaptermængde for forskellige mængder input-RNA.

Tabel 1-1 Den anbefalede Illumina-adaptermængde for forskelligt input-RNA

Tabel 1-2 Den anbefalede MGI-adaptermængde for forskelligt input-RNA

* Adapterbrug kan justeres i henhold til forskellige typer af samlede RNA-prøver og inputmængde

3.Biblioteksforstærkning

1) På basis af den første generations DNA-polymerase har high-fidelity-DNA-polymerasen i sættet i høj grad forbedret sin amplifikationsensartethed og udviser ingen amplifikationsbias.

2) Amplifikationscyklusnumre bør kontrolleres strengt. Utilstrækkelig amplifikation kan føre til lavt biblioteksudbytte; Overamplifikation kan introducere øget bias, fejl, duplikeret læsning, kimære produkter og akkumulering af ekspansionsmutationer. Tabel 2 viser de anbefalede cyklusnumre for PCR-amplifikation.

3) Det anbefalede antal cyklusser, der anbefales i tabel 2, kan opfylde langt de fleste krav til biblioteksforberedelse. Hvis din prøve er af dårlig kvalitet (såsom FFPE-prøver med alvorlig nedbrydning), kan antallet af cyklusser øges passende i henhold til den faktiske situation. Vær opmærksom på, at mRNA varierer fra forskellige arter og væv, antallet af amplifikationscyklusser bør justeres.

Tabel 2 Input Samlet RNA-volumen og amplifikationscyklusser anbefales Tabel *

[Bemærk]: *Bibliotekets udbytte er ikke kun relateret til inputmængden og antallet af amplifikationscyklusser, men påvirkes også af kvaliteten af ​​prøver, fragmenteringsbetingelser og sorteringsbetingelser. I processen med bibliotekskonstruktion skal du vælge de mest passende forhold i henhold til den faktiske situation.

4. Perlebaseret DNA-oprydning og størrelsesvalg

1) Der er flere trin i biblioteksopbygningsprocessen, der kræver magnetiske perler til DNA-oprensning. Vi anbefaler Hieff NGS™ DNA-selektionsperler (Yeasen Cat#12601) eller AMPure® XP magnetiske perler (Beckman Cat#A63880) til DNA-oprensning og størrelsesvalg.

2) Den magnetiske perle skal afbalanceres til stuetemperatur før brug, ellers udbyttet vil falde, og størrelsesvalgseffekten vil blive påvirket.

3) De magnetiske perler skal blandes godt ved vortex eller pipettering før brug.

4) Aspirer ikke perlerne, når supernatanten overføres, selv spormængder af perlerne kan påvirke følgende reaktioner.

5) De 80 % ethanol skal være frisklavet, ellers vil det påvirke genvindingseffektiviteten.

6) De magnetiske perler skal tørres ved stuetemperatur før eluering af produktet. Utilstrækkelig tørhed vil let få rester af ethanol til at påvirke efterfølgende reaktioner; overdreven tørhed vil få de magnetiske perler til at revne og reducere rensningsudbyttet. Normalt er tørring ved stuetemperatur i 3-5 minutter nok til at lade perlerne tørre helt.

7) Om nødvendigt kan de oprensede eller størrelsesvalgte DNA-prøver elueret i TE-buffer opbevares ved 4°C i 1-2 uger eller ved -20°C i en måned.

5.Bibliotekskvalitetsanalyse

Generelt kan kvaliteten af ​​det konstruerede bibliotek evalueres ved koncentrationsdetektion og længdefordelingsdetektion.

6. Andet materiale

1) mRNA-berigelseskit: Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit V2 (Yeasen Cat # 12629).

2) rRNA-fjernelsessæt: Hieff NGS® MaxUp Human rRNA-depletionskit (rRNA & ITS / ETS) (Yeasen Cat # 12257) eller andet rRNA-fjernelseskit.

3) RNA-rensning af magnetiske perler: Hieff NGS® RNA Cleaner (Yeasen Cat # 12602) eller andre tilsvarende produkter.

4) DNA-oprensede magnetiske perler: Hieff NGS® DNA-selektionsperler (Yeasen Cat # 12601) eller AMPure® XP-perler (A63880) eller andre tilsvarende produkter.

5) RNA kvalitetskontrol: Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano / Pico Chip eller andre tilsvarende produkter.

6) Adaptere: Komplet adapter til Illumina®-brug (kat. nr. 13519-13520 eller anden tilsvarende) eller komplet adapter til MGI®-brug (kat. nr. 13360-13362 eller anden tilsvarende).

7. Bibliotekskvalitetsinspektion

Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip / High Sensitivity Chip eller andre tilsvarende produkter; bibliotekskvantificeringsreagenser.

8. Andre materialer

Vandfri ethanol, sterilt ultrarent vand, lavadsorptionspistolhoved, PCR-rør, magnetisk ramme, PCR-instrument osv.

Flowdiagram

Figur 1: RNA-biblioteksopbygningsproces

RNA Library forberedelse til forskellige kvalitets FFPE prøver

For alvorligt nedbrudt FFPE-RNA (DV 200 <50%) og prøver med lav input anbefaler vi en dobbeltoprensningsprotokol efter adapterligering for at reducere bibliotekstab.

Peak mønstre af forskellige kvalitets FFPE prøver