Hieff NGS^TM DNA Library Prep Kit er en ny generation af biblioteksbyggesæt specielt udviklet og designet til Illumina® &MGI® sekventeringsplatform. På basis af den tidligere generation af biblioteksbyggesæt udviser dette produkt højere effektivitet i slutreparation, dA-tailing og adapterligering end de tidligere versioner. High-fidelity-enzymet forbedrer markant ensartetheden og pålideligheden af ​​amplifikation. Sættet er kompatibelt med de fleste DNA-prøvetyper, inklusive standard genomisk DNA fra dyr/planter/mikroorganismer, FFPE-prøver, cfDNA og ChIP-DNA.

Specifikationer

Komponenter

Opbevaring

Dette produkt skal opbevares ved -25~-15 ℃ til 1 år.

Noter

1. Om operationen

1. Brug venligst laboratoriefrakker og engangshandsker, for din sikkerhed.

2. Tø komponenterne op ved stuetemperatur. Efter optøning, bland grundigt ved vortexing, drej røret kort og læg dem på is til senere brug.

3. Når du forbereder reaktionsopløsningen for hvert trin, anbefales det at bruge en pipette til at blande godt eller forsigtigt ryste. Kraftig rystning kan forårsage et fald i bibliotekets output.

4. Det anbefales stærkt at bruge filtrerede pipettespidser for at undgå krydskontaminering. Sørg for at skifte pipettespidser, når du behandler forskellige prøver.

5. Ukorrekt betjening kan højst sandsynligt forårsage aerosolkontamination, hvilket påvirker resultatets nøjagtighed. Obligatorisk fysisk isolering af PCR-reaktionsblandingsregioner og PCR-produktoprensningsassayregioner anbefales. Udstyret med udstyr såsom specialiserede pipetter til biblioteksbyggeri.Udfør rutinerengøring for hvert område ved at tørre overfladerne af med 0,5 % natriumhypoklorit eller 10 % blegemiddel

6. Dette produkt er kun til forskningsbrug.

2. DNA-fragmentering

1. Dette sæt er kompatibelt med enten mekanisk fragmenteret DNA eller enzymatisk fragmenteret DNA.

2. Sættet er kompatibelt med 100 pg - 1000 ng input DNA. Det anbefales stærkt at bruge input-DNA af høj kvalitet med A260/A280 = 1,8-2,0. Tabel 1 viser den anbefalede mængde af input-DNA.

Tabel 1 Den anbefalede mængde af input-DNA

Note: Når input-DNA'et er af dårlig kvalitet, eller DNA-størrelsesvalg er påkrævet, bør input-DNA-mængden øges tilsvarende.

3."Input DNA" refererer specifikt til de DNA-prøver, der er klar til slutreparation/dA tailing.

4. Et trin til oprensning af perler/størrelsesudvælgelse anbefales efter fragmentering, hvis input-DNA-prøven indeholder høje koncentrationer af salte som metalchelateringsmidlet. Saltene kan påvirke effektiviteten af ​​følgende reaktioner, inklusive slutreparation og dA-tailing. Eluer venligst DNA-prøverne i TE-buffer i stedet for steriliseret ultrarent vand til fragmentering, hvis du bruger den mekaniske fragmenteringsmetode. Hvis du bruger den enzymatiske fragmenteringsmetode uden at udføre perleoprydning eller størrelsesvalg, før du fortsætter til biblioteksforberedelse, skal du sikre dig, at den anvendte stopbuffer ikke indeholder mere end metalchelateringsmiddel. Ellers skal du rydde op eller vælge størrelsen på de fragmenterede prøver og eluere dem i TE-buffer eller steriliseret ultrarent vand (≤50 μL), før du fortsætter til biblioteksforberedelse.

3. Adapter Ligation

1. Illumina eller MGI Long Adapter (Barcoded Adapter)-sæt og korte Adapter-sæt er tilgængelige for kunderne at vælge i henhold til deres eksperimentelle krav.

2. Det blev anbefalet at vælge kommercielle adaptere af høj kvalitet. Hvis selvfremstillede adaptere vælges, bedes du overlade en virksomhed med erfaring i NGS-primersyntese og bemærke behovet for streng kontamineringskontrol. Derudover anbefales det at forberede DNA-annealing-opløsning på en ren bænk og kun betjene én type adapter hver gang for at forhindre krydskontaminering.

3. Optø venligst adapterne på isen eller ved 4°C; ved stuetemperatur bør laboratorietemperaturen ikke overstige 25°C for at forhindre adapterne i at denaturere.

4. Adapternes kvalitet og koncentration vil direkte påvirke ligeringseffektiviteten og biblioteksudbyttet. For høj koncentration af adaptere favoriserer adapterdimerdannelse, mens for lidt adapter reducerer ligeringshastighed og biblioteksudbytte. Tilsvarende fortyndinger med TE-buffer i henhold til input-DNA-mængde ved brug af Adapter.Tabel 2 -5 viser de anbefalede adapterfortyndingsmetoder for forskellige input-DNA-mængder ved brug af dette sæt.

Tabel 2 Den anbefalede Illumina^TM adaptermængde for forskelligt input DNA

Tabel 3 Den anbefalede MGI^TM adaptermængde for forskelligt input DNA

Tabel 4 Den anbefalede Illumina^TM UMI adaptermængde for forskelligt input DNA

Tabel 5 Den anbefalede MGI^TM UMI adapter amcount for forskelligt input DNA

4. Perlebaseret DNA-oprydning og størrelsesvalg

1. DNA-størrelsesudvælgelse kan udføres før endereparation/dA-tailing, efter adapterligering eller efter amplifikation.

2. Det anbefales at udføre størrelsesvalg lige efter adapterligering, hvis input-DNA-mængden er mere end 50 ng; Ellers skal du vælge størrelse efter forstærkning.

3. Ligation Enhancer indeholder en høj koncentration af PEG, som kan have en betydelig indvirkning på nøjagtig størrelsesvalg. Hvis størrelsesvalg skal udføres lige efter adapterligering, anbefales det derfor kraftigt at tilføje et trin til oprydning af perler før størrelsesvalget. Størrelsesvalgstrin kan udføres direkte, hvis det udføres før slutreparation/dA-tailing eller efter biblioteksforstærkningen.

4. De magnetiske perler skal ækvilibreres ved stuetemperatur før brug, ellers vil udbyttet falde, og størrelsesvalgseffekten påvirkes.

5. De magnetiske perler skal blandes godt ved vortex eller pipettering før brug.

6. Aspirer ikke perlerne, når supernatanten overføres, selv spormængder af perlerne kan påvirke følgende reaktioner.

7. De 80 % ethanol skal være frisklavet, ellers vil det påvirke genvindingseffektiviteten.

8. For nøjagtigt størrelsesvalg anbefales det at starte med en volumen på mere end 100 μL. Hvis mindre, anbefales det at bringe volumen op til 100 μL med ultrarent vand.

9. De magnetiske perler skal tørres ved stuetemperatur før eluering af produktet. Utilstrækkelig tørhed vil let få rester af ethanol til at påvirke efterfølgende reaktioner; overdreven tørhed vil få de magnetiske perler til at revne og reducere rensningsudbyttet. Normalt er tørring ved stuetemperatur i 3-5 minutter nok til at lade perlerne tørre helt.

10. Om nødvendigt eluerede de oprensede eller størrelsesudvalgte DNA-prøver ind 0,1× TE-buffer kan opbevares ved 4°C i 1-2 uger eller ved -20°C i en måned.

5. Biblioteksforstærkning

1. Hvorvidt der skal udføres biblioteksforstærkning eller ej, afhænger af mængden af ​​DNA-input, typer af adaptere, sekventeringsdataapplikationer osv. Amplifikationstrinnet er påkrævet, hvis der bruges delvise adaptere. Ved brug af fuld-længde adaptere, hvis input-DNA <200 ng, anbefales det at udføre amplifikation; ellers er forstærkning ikke nødvendig.

2. Amplifikationscyklusnumre bør kontrolleres strengt. Utilstrækkelig amplifikation kan føre til lavt biblioteksudbytte; Overamplifikation kan introducere øget bias, fejl, duplikeret læsning og kimære produkter. Tabel 6 viser anbefalede cyklusnumre, der er målrettet biblioteksudbyttet på 1 μg.

Tabel 6 Det anbefalede antal cyklusser, der skal genereres 1.000 ng biblioteksudbytte

Note:

1.Tabel 6 viser antallet af loop-parametre ved hjælp af højkvalitets Input DNA-tests på omkring 200 bp. FFPE DNA-kvaliteten varierer meget, og når DNA-kvaliteten er dårlig eller bibliotekslængden er lang, skal antallet af cyklusser øges passende for at opnå tilstrækkelige biblioteker.

2.jegHvis størrelsesvalg er påkrævet under biblioteksopbygningsprocessen, anbefales et højere cyklustal for biblioteksforstærkning; ellers anbefales lavere cyklusnummer.

3.jegHvis der bruges ufuldstændige adaptere, skal mindst 2 cyklusser forstærkes for at danne en komplet adapter.

6. Bibliotekskvalitetsanalyse

1. Kvaliteten af ​​de konstruerede biblioteker analyseres generelt ved at måle koncentrationer og størrelsesfordelinger.

2. Biblioteker'koncentrationer kan måles ved hjælp af fluorescensbaserede metoder såsom Qubit og PicoGreen eller qPCR.

3.Det anbefales IKKE at bruge absorbansbaserede kvantificeringsmetoder såsom NanoDrop.

4. Det anbefales at bruge qPCR-metoden til bibliotekskvantificering: fluorescensbaserede metoder som Qubit og PicoGreen kan ikke differentiere de ufuldstændige dsDNA-strukturer (inserts uden adapter eller med kun en af ​​enderne ligeret med adapter) fra de komplette biblioteker. qPCR-metoden vil kun amplificere og måle de komplette biblioteker med begge ender ligeret med adaptere (de sekventerbare biblioteker), hvilket giver en mere nøjagtig måling til indlæsning.

5. Størrelsesfordelingen af ​​biblioteker kan analyseres ved hjælp af Agilent Bioanalyzer eller andre enheder baseret på principperne for kapillær elektroforese eller mikrofluidik.

7. Andre materialer

1. DNA-oprensningsmagnetiske perler: Hieff NGS^TM DNA-selektionsperler (Yeasen Cat#12601) eller AMPure^® XP Beads (A63880) eller andre tilsvarende produkter.

2. Adaptere: Komplet adapter til Illumina: Yeasen Cat#13519-13520; 384 Dual CDI Primere: Yeasen Kat#12412~Kat#12413; 384 Unique Dual Index (UDI) Primere: Yeasen Kat #12312~Kat #12315; UMI UDI adaptere: Yeasen Kat#13370~Kat#13371; Komplet adapter til MGI: Yeasen Cat#13360-13362. DNA Primer Mix:Kat#12190 eller Kat#12191.

3. Bibliotekskvalitetsanalyse: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip eller andre tilsvarende produkter; bibliotekets kvantitative reagenser.

4. Andre materialer: absolut ethanol, sterilt ultrarent vand, pipettespidser med lav retention, PCR-rør, magnetiske stativer, termocykler osv.

Instruktioner

Trin 1. End Repair/dA-Taling

1. Tø reagenserne nævnt i tabel 7 . Vend om for at blande reagenserne grundigt og læg dem på is til senere brug.

2. Saml reagenserne i henhold til tabel 7 på is.

Tabel 7 End Repair/dA-Tailing reaktionssystem

3. Bland forsigtigt ved pipettering eller omrystning, Centrifuger kort for at få opløsningen ned.

4. Placer røret i en termocykler og indstil programmet i henhold til tabel 8 .

Tabel 8 End Repair/dA-Tailing reaktionsprogram

Trin 2. Adapter Ligation

1. Fortynd adapteren til den passende koncentration i henhold til tabel 2-5.

2. Tø reagenserne nævnt i tabel 9 . Vend om for at blande reagenserne grundigt og læg dem på is til senere brug.

3. Saml reagenserne i henhold til tabel 9 på is.

Tabel 9 Adapter Ligation vedrhandlingssystem

Note: * Ligation Enhancer er tyktflydende. Bland venligst grundigt ved at vende eller vende og centrifuger kort før brug.

**Den oprindelige koncentration af Illumina^TM adapteren til YEASE er 15 μM. Fortynd venligst adapteren i henhold til inputmængden og gør adapterens volumen fastgjort til 5 μL.

**Den oprindelige koncentration af MGI^TM adapteren til YEASE er 10 μM. Fortynd venligst adapteren i henhold til inputmængden og gør adapterens volumen fastgjort til 5 μL.

4. Bland grundigt ved forsigtigt at pipettere op og ned og centrifugere kortvarigt for at opsamle al væske fra siderne af røret.

5. Inkuber prøven i en forvarmet termisk cyklus som vist i tabel 10 og udfør adaptertilslutningsreaktionen.

Tabel 10 Adapter Ligation reaktionsprogram

Trin 3. Oprydnings- eller størrelsesvalgspost Adapterligering

Dette trin er at rense eller størrelsesvælge produktet i trin 2 med magnetiske perler. Oprensningen kan fjerne rester af adaptere, adapterdimere eller andre ubrugelige produkter.

Clean op af Adapter-ligeret DNA

1. Forberedelse: Tag Hieff NGS^TM DNA-selektionsperler ud af køleskabet og ækvilibrer ved stuetemperatur i mindst 30 minutter. Forbered 80% ethanol frisk.

2. Bland perlerne grundigt ved at vende dem om eller vende dem i top.

3. Tilføje 88 μL Hieff NGS^TM DNA-selektionsperler (0.8×, perler: DNA = 0.8:1) til røret, der indeholder det adapterligerede produkt, ryst og bland godt, og inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter.

4. Centrifuger kortvarigt for at få opløsningen ned, og anbring centrifugerøret på det magnetiske stativ. Efter at de magnetiske perler er fuldstændigt adsorberet (ca. 5 min), skal du forsigtigt fjerne væsken.

5. Hold røret på det magnetiske stativ, tilsæt direkte 200 μL frisklavet 80 % ethanol til røret. Inkuber ved stuetemperatur i 30 sekunder og fjern forsigtigt væsken.

6. Gentage trin 5 igen.

7. Hold røret på det magnetiske stativ, åbn hætten og tør perlerne, indtil perlerne netop er revnet (ikke mere end 5 minutter).

8. Tag røret af det magnetiske stativ til eluering og eluere DNA'et

1). Hvis produktet ikke skal vælges i størrelse, tilsættes 21 μL ddH₂O direkte. Bland grundigt ved at vortexe eller pipettere op og ned 10 gange. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min. Drej røret kort og anbring det på magnetisk stativ. Når opløsningen er klar (ca. 5 min), overføres 20 μL supernatant til et nyt PCR-rør forsigtigt uden at røre de magnetiske perler.

2). Hvis produktet skal vælges i størrelse, tilføjes 102 μL ddH₂O direkte. Bland grundigt ved at vortexe eller pipettere op og ned 10 gange. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min. Drej røret kort og anbring det på magnetisk stativ. Når opløsningen er klar (ca. 5 min), overføres forsigtigt 100 μL supernatant til et nyt PCR-rør uden at røre de magnetiske perler.

Note: Hvis det rensede produkt skal opbevares, kan det elueres med TE Buffer.

Størrelsesvalg af adapter-ligeret DNA

1.Forberedelse: Tag Hieff NGS^TM DNA-selektionsperler ud af køleskabet og ækvilibrer ved stuetemperatur i mindst 30 minutter. Forbered 80% ethanol frisk.

2. Bland perlerne grundigt ved at vende dem om eller vende dem i top.

3. Baseret på de målrettede størrelser, tilføj den første runde perler til de 100 μL oprensede DNA-skabeloner i henhold til tabel 11. Bland grundigt ved vortexing eller pipettering 10 gange.

Tabel 11 Anbefalede perler: DNA-forhold til perlebaseret størrelsesvalg

Note: "×" i tabellen angiver volumenet af DNA-prøven. For eksempel, hvis insertlængden af ​​biblioteket er 250 bp, og prøvens DNA-volumen er 100 μL, er volumenet af magnetiske perler, der anvendes i den første sorteringsrunde, 0,7×100 μL=70 μL; volumenet af magnetiske perler brugt i anden sorteringsrunde er 0,20× 100 μL=20 μL. Det anbefalede perlevolumen i tabellen er for det adapterligerede DNA. Hvis størrelsesudvælgelsesproceduren udføres før ligering, se venligst Hieff NGS's fremstillingsprotokoller^TM DNA-selektionsperler (kat#12601).

4. jegkubér ved stuetemperatur i 5 minutter.

5. Drej røret kort og anbring det på magnetisk stativ. Når opløsningen er klar (ca. 5 min), overføres supernatanten til et nyt PCR-rør.

6. Tilføj den anden runde af udvælgelsesperler til prøven fra trin 5 ifølge tabel 11.Bland grundigt ved at vortexe eller pipettere op og ned mindst 10 gange.

7. jegkubér ved stuetemperatur i 5 minutter.

8. Centrifuger kortvarigt for at få opløsningen ned, og anbring centrifugerøret på det magnetiske stativ. Efter at de magnetiske perler er fuldstændigt adsorberet (ca. 5 min), skal du forsigtigt fjerne væsken.

9. Hold røret på det magnetiske stativ, tilsæt direkte 200 μL frisklavet 80 % ethanol til røret. Inkuber ved stuetemperatur i 30 sekunder og fjern forsigtigt væsken.

10. Gentage trin 9 igen.

11. Hold røret på det magnetiske stativ, åbn hætten og tør perlerne, indtil perlerne netop er revnet (ikke mere end 5 minutter).

12. Tag røret af det magnetiske stativ til eluering, og tilsæt direkte 21 μL ddH₂O. Bland grundigt ved at vortexe eller pipettere op-og-ned og inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter. (Bemærk: Hvis det er nødvendigt at opbevare det rensede produkt, elueres det i TE-buffer.) Drej kortvarigt røret ned og anbring det på et magnetisk stativ, indtil væsken bliver klar (ca. 5 minutter). Overfør forsigtigt 20 μL supernatant til et nyt PCR-rør uden at røre ved perlerne.

Trin 4 Biblioteksforstærkning

Dette trin kan berige de oprensede eller størrelsesvalgte produkter ved PCR-amplifikation.

1. Optøn reagenslisten i tabellen 12, vend og bland grundigt, og læg dem på is til senere brug.

2. Saml følgende reaktion i et steriliseret PCR-rør.

Tabel 12 adapter-ligeret DNA PCR-reaktion system

[Note]: * hvis den komplette adapter blev brugt, Hieff NGS^TM Primer blanding (Yeasen kat #12190 eller kat#12191) i behov; Hvis der bruges en ufuldstændig adapter (kat#12412~kat#12413, kat#12312~Kat #12315, Cat#13370~Cat#13371), se venligst kitinstruktionerne og brug Index Primer, der følger med sættet, til amplifikation.

3. Bland forsigtigt ved pipettering eller omrystning, og centrifuger kortvarigt for at få opløsningen ned.

4. Sæt røret i en termocykler og indstil programmet i henhold til tabel 13 for at starte forstærkningen.

Tabel 13 PCR amplifikationsreaktionsprogram

Trin 5 Post-amplifikation oprydning/størrelsesvalg

Det rene op trin henvises til trin 3. Hieff NGS^TM DNA-selektionsperler (0,9×, perler:DNA=0,9:1) bruges til at oprense PCR-produktet. Hvis det er nødvendigt at vælge størrelse, se venligst trin 3.

Trin 6 Kvalitetskontrol af de endelige biblioteker

Kvaliteten af ​​det konstruerede bibliotek vurderes generelt ved at måle koncentrationen og størrelsesfordelingen. For detaljer henvises til bemærkning 6.