Hieff NGS™ OnePot Pro DNA Library Prep Kit V4 er et næste generations enzymbiblioteksforberedelseskit designet til brug med Illumina og MGI high-throughput sekventeringsplatforme. Sammenlignet med traditionelle biblioteksforberedelsesmetoder bruger dette kit fragmenteringsenzymer af høj kvalitet, hvilket eliminerer behovet for besværlige sonikeringsprocesser. Fragmenterings- og slutreparationsmodulerne kombineres i et enkelt trin, hvilket reducerer både tid og omkostninger ved biblioteksforberedelse betydeligt. Dette sæt er velegnet til en lang række prøvetyper, herunder plante- og dyregenomer, mikrobielle genomer og mere, med et prøveinputområde på 1 ng til 1 μg. Den enzymatiske fragmentering sikrer ensartede fragmentstørrelser på tværs af forskellige arter med minimal variation mellem arterne. Derudover kan dette sæt parres med Illumina eller MGI adaptere og primere til sekventering på Illumina eller MGI high-throughput platforme.

Specifikationer

Komponenter

Opbevaring

Dette produkt skal opbevares ved -25~-15 ℃ i 1 år.

Noter

1. Om operationen

1. Brug venligst laboratoriefrakker og engangshandsker，for din sikkerhed.

2. Tø komponenterne op ved stuetemperatur. Efter optøning, bland grundigt ved vortexing, drej røret kort og læg dem på is til senere brug.

3. Når du forbereder reaktionsopløsningen for hvert trin, anbefales det at bruge en pipette til at blande godt eller forsigtigt ryste. Kraftig rystning kan forårsage et fald i bibliotekets output.

4. Det anbefales stærkt at bruge filtrerede pipettespidser for at undgå krydskontaminering. Sørg for at skifte pipettespidser, når du behandler forskellige prøver.

5. Ukorrekt betjening kan højst sandsynligt forårsage aerosolkontamination, hvilket påvirker resultatets nøjagtighed. Obligatorisk fysisk isolering af PCR-reaktionsblandingsregioner og PCR-produktoprensningsassayregioner anbefales. Udstyret med udstyr såsom specialiserede pipetter til biblioteksbyggeri.Udfør rutinerengøring for hvert område ved at tørre overfladerne af med 0,5 % natriumhypoklorit eller 10 % blegemiddel

6. Dette produkt er kun til forskningsbrug.

1. Sættet er kompatibelt med 100 pg - 1000 ng input DNA. Det anbefales stærkt at bruge input-DNA af høj kvalitet med A260/A280 = 1,8-2,0.

2. Følgende eksperimenter kunne påvirkes, hvis høje koncentrationer af salte som metalchelateringsmidlet blev introduceret med input-DNA'et. Vi anbefaler at eluere DNA-prøven ind ddH₂O til fragmentering.

3. Se venligst tabellen 6 for fragmenteringstiden af ​​standard DNA-prøver.Sættet har lav fragmenteringsbias og giver ensartet GC-dækning for DNA-prøver med en bred vifte af GC-sammensætninger. Juster venligst fragmenteringstiden baseret på dine eksperimentelle krav.

4. For nøjagtig fragmentering skal du forberede reaktionen på is.

3. Adapter Ligation

1. Illumina eller MGI Long Adapter (Barcoded Adapter)-sæt og korte Adapter-sæt er tilgængelige for kunderne at vælge i henhold til deres eksperimentelle krav.

2. Det blev anbefalet at vælge kommercielle adaptere af høj kvalitet. Hvis selvfremstillede adaptere vælges, bedes du overlade en virksomhed med erfaring i NGS-primersyntese og bemærke behovet for streng kontamineringskontrol. Derudover anbefales det at forberede DNA-annealing-opløsningen på en ren bænk og kun betjene én type adapter hver gang for at forhindre krydskontaminering.

3. Optø venligst adapterne på isen eller ved 4°C; ved stuetemperatur bør laboratorietemperaturen ikke overstige 25°C for at forhindre adapterne i at denaturere.

4. Adapternes kvalitet og koncentration vil direkte påvirke ligeringseffektiviteten og biblioteksudbyttet. For høj koncentration af adaptere favoriserer adapterdimerdannelse, mens for lidt adapter reducerer ligeringshastighed og biblioteksudbytte. Tilsvarende fortyndinger med TE-buffer i henhold til input-DNA-mængde ved brug af Adapter.Tabel 2 -3 viser de anbefalede adapterfortyndingsmetoder for forskellige input-DNA-mængder ved brug af dette sæt.

Tabel 1 Den anbefalede Illumina-adaptermængde til forskelligt input-DNA

Tabel 2 Den anbefalede MGI-adaptermængde for forskelligt input-DNA

4. Perlebaseret DNA-oprydning og størrelsesvalg

1. DNA-fragmentstørrelseselektionstrinnet kan udføres enten efter adapterligering eller efter bibliotekamplifikation.

2. Det anbefales at udføre størrelsesvalg lige efter adapterligering, hvis input-DNA-mængden er mere end 50 ng; Ellers skal du vælge størrelse efter forstærkning.

3. Ligation Enhancer indeholder en høj koncentration af PEG, som kan have en betydelig indvirkning på nøjagtig størrelsesvalg. Hvis størrelsesvalg skal udføres lige efter adapterligering, anbefales det derfor kraftigt at tilføje et trin til oprydning af perler før størrelsesvalget. Størrelsesvalgstrin kan udføres direkte, hvis det udføres før slutreparation/dA-tailing eller efter biblioteksforstærkningen.

4. De magnetiske perler skal ækvilibreres ved stuetemperatur før brug, ellers vil udbyttet falde, og størrelsesvalgseffekten påvirkes.

5. De magnetiske perler skal blandes godt ved vortex eller pipettering før brug.

6. Aspirer ikke perlerne, når supernatanten overføres, selv spormængder af perlerne kan påvirke følgende reaktioner.

7. De 80 % ethanol skal være frisklavet, ellers vil det påvirke genvindingseffektiviteten.

8. For nøjagtigt størrelsesvalg anbefales det at starte med en volumen på mere end 100 μL. Hvis mindre, anbefales det at bringe volumen op til 100 μL med ultrarent vand.

9. De magnetiske perler skal tørres ved stuetemperatur før eluering af produktet. Utilstrækkelig tørhed vil let få rester af ethanol til at påvirke efterfølgende reaktioner; overdreven tørhed vil få de magnetiske perler til at revne og reducere rensningsudbyttet. Normalt er tørring ved stuetemperatur i 3-5 minutter nok til at lade perlerne tørre helt.

10. Om nødvendigt eluerede de oprensede eller størrelsesudvalgte DNA-prøver ind 0,1× TE-buffer kan opbevares ved 4°C i 1-2 uger eller ved -20°C i en måned.

5. Biblioteksforstærkning

1. Hvorvidt der skal udføres biblioteksforstærkning eller ej, afhænger af mængden af ​​DNA-input, typer af adaptere, sekventeringsdataapplikationer osv. Amplifikationstrinnet er påkrævet, hvis der bruges delvise adaptere. Ved brug af fuld-længde adaptere, hvis input-DNA <200 ng, anbefales det at udføre amplifikation; ellers er forstærkning ikke nødvendig.

2. Amplifikationscyklusnumre bør kontrolleres nøje. Utilstrækkelig amplifikation kan føre til lavt biblioteksudbytte; Overamplifikation kan introducere øget bias, fejl, duplikeret læsning og kimære produkter. Tabel 3 viser anbefalede cyklusnumre, der er målrettet biblioteksudbyttet på 1 μg.

Tabel 3 Det anbefalede antal cyklusser, der skal genereres 1.000 ng biblioteksudbytte

Note:

1.Tabel 3 viser antallet af loop-parametre ved hjælp af højkvalitets Input DNA-tests på omkring 200 bp. FFPE DNA-kvaliteten varierer meget, og når DNA-kvaliteten er dårlig eller bibliotekslængden er lang, skal antallet af cyklusser øges passende for at opnå tilstrækkelige biblioteker.

2.jegHvis størrelsesvalg er påkrævet under biblioteksopbygningsprocessen, anbefales et højere cyklustal for biblioteksforstærkning; ellers anbefales lavere cyklusnummer.

3.jegHvis der bruges ufuldstændige adaptere, skal mindst 2 cyklusser forstærkes for at danne en komplet adapter.

6. Bibliotekskvalitetsanalyse

1. Kvaliteten af ​​de konstruerede biblioteker analyseres generelt ved at måle koncentrationer og størrelsesfordelinger.

2. Bibliotekernes koncentrationer kan måles ved hjælp af fluorescensbaserede metoder såsom Qubit og PicoGreen eller qPCR.

3. Det anbefales IKKE at bruge absorbansbaserede kvantificeringsmetoder såsom NanoDrop.

4. Det anbefales at bruge qPCR-metoden til bibliotekskvantificering: fluorescensbaserede metoder som Qubit og PicoGreen kan ikke differentiere de ufuldstændige dsDNA-strukturer (inserts uden adapter eller med kun en af ​​enderne ligeret med adapter) fra de komplette biblioteker. qPCR-metoden vil kun amplificere og måle de komplette biblioteker med begge ender ligeret med adaptere (de sekventerbare biblioteker), hvilket giver en mere nøjagtig måling til indlæsning.

5. Størrelsesfordelingen af ​​biblioteker kan analyseres ved hjælp af Agilent Bioanalyzer eller andre enheder baseret på principperne for kapillær elektroforese eller mikrofluidik.

7. Andre materialer

1. DNA-oprensningsmagnetiske perler: Hieff NGS^TM DNA-selektionsperler (Yeasen Cat#12601) eller AMPure^® XP Beads (A63880) eller andre tilsvarende produkter.

2. Adaptere: Komplet adapter til Illumina: Yeasen Cat#13519-13520; 384 Dual CDI Primere: Yeasen Kat#12412~Kat#12413; 384 Unique Dual Index (UDI) Primere: Yeasen Kat #12327~Kat #13330; UMI UDI adaptere: Yeasen Kat#13370~Kat#13371; Komplet adapter til MGI: Yeasen Cat#13360-13362. DNA Primer Mix:Kat#12190 eller Kat#12191.

3. Bibliotekskvalitetsanalyse: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip eller andre tilsvarende produkter; bibliotekets kvantitative reagenser.

4. Andre materialer: absolut ethanol, sterilt ultrarent vand, pipettespidser med lav retention, PCR-rør, magnetiske stativer, termocykler osv.

8. Arbejdsgang

Figur 1.Arbejdsgangen af OnePot Pro DNA Biblioteksforberedelseskit