Hifair™ V Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit (UDG Plus) er et multipleks kvantitativt PCR-kit baseret på RNA som skabelon. I forbindelse med forsøget blev der udført revers transkription og kvantitativ PCR i samme rør, hvilket forenklede den eksperimentelle operation og reducerede risikoen for kontaminering.

I dette kit blev den første streng cDNA syntetiseret effektivt af varmeresistent Hifair^TM V Revers Transcriptase og kvantitativt amplificeret af UNICON^TM HotStart Taq DNA-polymerase. Sættet indeholder hovedsageligt optimeret MP-buffer, enzymblanding osv. Pufferopløsningen indeholder allerede Mg²⁺ og dNTP. Derudover tilføjes de faktorer, der effektivt kan hæmme den ikke-specifikke PCR-amplifikation og forbedre amplifikationseffektiviteten af ​​flere qPCR-reaktioner, hvilket kan sikre amplifikationseffektiviteten og udføre op til multiple amplifikationsreaktioner. dUTP/UDG-systemet blev tilføjet for effektivt at forhindre risikoen for aerosolkontamination.

Funktioner

Høj følsomhed:Det omhyggeligt optimerede buffersystem forbedrer detektionsfølsomheden af ​​skabeloner med lav koncentration op til 250 kopier/ml；

Super stabilitet: Produktet har bestået stabilitetstest i realtid i 18 måneder.

dUP/UDG anti-forureningssystem:dUTP/UDG anti-forureningssystem introduceres for at nedbryde aerosolforurening af produkter effektivt, reducere falsk positiv og sikre autentiske resultater；

Understøtter hurtigt program: kompatibel med hurtigt program, 40min kan producere resultater;

Komponenter

Note: 1) 2×Hifair^TM V MP buffer er forkortelsen af Hifair^TM V Multiplex One Step RT-qPCR Probe Buffer, som inkluderer dNTP'er, dUTP, Mg2+, stabilisatorer, forstærkere og mere.

2) Hifair^TM V enzymblanding hovedsagelig indeholder varmebestandig Hifair^TM V revers transkriptase, UNICONTM HotStart Taq DNA-polymerer og UDGase.

Opbevaring

Than produkt skulle være gemt på -25°C~-15°C for 18 måneder.

Instruktioner

Reaktionssammensætning

Note:Sørg for at blande godt før brug, undgå for store bobler forårsaget af voldsomme vibrationer.

a) Primer/Sonde koncentration: Primer blanding inklusive multiplex primer, afhængig af situationen kan den optimale primerkoncentration være mellem 0,1 og 1,0 μM.Probeblanding inklusive multiplex probemærkning af forskellen fluorescerende gruppe, afhængigt af situationen kan den optimale probekoncentration være mellem 0,05 og 0.5 μM.

c) Skabelonfortynding: qPCR er meget følsom, og det anbefales at fortynde skabelonen. Kontrol-Ct-værdien er egnet mellem 20 og 35.

d) Systemforberedelse: afhoved med filterelement. Undgå krydskontaminering og aerosolkontamination.

Optimeret cykelprotokol

Note:a) Romvendt transskription: Temperaturen kan vælge 42°C eller 50°C i 10-15 minutter.

b) Amplifikationsreaktion: Temperaturen justeres i henhold til Tm-værdien af ​​de designede primere.

c) Fluorescenssignalopsamling: Indstil venligst den eksperimentelle procedure i overensstemmelse med kravene i instrumentmanualen.

3. Anvendelse udstyr

Udstyr med Rox:ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™

Udstyr med Low Rox:ABI 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 og 5, QuantStudio™ 6,7,12k Flex

Stratagene MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™

Udstyr uden Rox:

Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon® 2, Chromo4™

Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2 s; Qiagen Corbett Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000

Roche Applied Science LightCycler® 480, LightCycler® 2.0, Lightcycler® 96

Termo Videnskabelig PikoReal Cycler; Cepheid SmartCycler®; Illumina Eco qPCR

Noter

Bær venligst det nødvendige PPE, såsom laboratoriefrakke og handsker, for at sikre din sundhed og sikkerhed!

Brug venligst RNasefri forbrugsstoffer for eksperimentet.

Følsomhedstest

13650 opbevaret ved -20°C i 18 måneder (eksperimentel gruppe) og dem inden for holdbarheden (kontrolgruppe) blev samtidigt testet for gradientfortynding (500 kopier/ml, 250 kopier/ml) af pseudovirus SARS-CoV-2, målrettet mod ORF-genet og N-genet. Otte replikatbrønde blev testet for hver koncentration med en detektionsrate på 100 %. Desuden var der ingen signifikante forskelle i amplifikationskurvens topformer og Ct-værdier.

Stabilitetstest i realtid

13650 opbevaret ved -20°C i 18 måneder og inden for deres holdbarhed. Begge grupper blev testet samtidigt for SARS-CoV-2 pseudovirus ORF-genet og N-genet i en koncentration på 1000 kopier/ml med 20 replikatbrønde. Detektionshastigheden for begge var 100 %, og der var ingen signifikante forskelle i formen af ​​amplifikationskurverne eller Ct-værdierne.

Figur 1. Red: 13650 inden for deres holdbarhed；blå:13650 opbevaret ved -20°C i 18 måneder.

Stabil ydeevne efter gentagne fryse-tø-cyklusser

Ved at udsætte 13650-reagenset for 30 og 50 fryse-tø-cyklusser ved brug af tøris, sammen med reagenser, der opbevares normalt ved -20°C, og samtidig testning for SARS-CoV-2 pseudovirus ORF-genet, viste resultaterne, at ydeevnen af ​​13650-reagenset var upåvirket efter nedfrysning af 50-cyklus.

Figur 2. Rød: 13650 opbevaret normalt ved -20°C; Lilla:13650 til 30 fryse-tø-cyklusser；Grøn:13650 til 50 fryse-tø-cyklusser.

Kompatibel med standard- og hurtigprotokoller

Ved anvendelse af 13650ES blev ORF-genet og N-genet af SARS-CoV-2-pseudovirus påvist under det samme reaktionssystem med både standard- og hurtige protokoller. Resultaterne viste, at under et 4-plex-system var der ingen forskel i amplifikationskurvens topformer og Ct-værdier mellem de to protokoller.

Dokumenter:

Manualer