kittet er udstyret med en kraftig lysisbuffer, som hurtigt kan lysere prøver (f.eks. celler, musehale, museøre, musetå, muskel osv.) for at frigive genomisk DNA, og lysatet kan tilsættes direkte til PCR-reaktionssystemet uden oprensning, hvilket er praktisk til drift. Derudover kræver dette sæt lav prøveinput, 5 mg musevæv eller 1-5 mm musehale kan bruges til eksperimenter.

Komponenter

Opbevaring

19697-A (Lysis Solution) skal opbevares kl 2~8℃ for 1 år. Hvis det bruges flere gange, bedes du fryse i separate pakker for at undgå krydskontaminering. 19687-B (Stopløsning) skal opbevares kl -25~-16℃ for 1 år.

Instruktioner

Genomisk DNA-frigivelse fra mus

1. Klip 5-10 mg dyrevæv eller 1-5 mm musehale i et 1,5 ml centrifugerør*.
2. Tilsæt 90 μL Buffer ML til ovenstående centrifugerør, vortex forsigtigt for fuldstændigt at infiltrere prøven med lysatet, og centrifuger kortvarigt.
3. Inkuber ved 95°C i 15 minutter i en termostatisk inkubator**.
4. Tilsæt 10 μL Buffer MT, svirp for at blande, og afslut lyseringen.
5. Valgfrit trin: centrifugering ved 12000 rpm i 2 min.
6. Overfør supernatanten til et nyt centrifugerør og opbevar ved 4 °C eller -20 °C eller tag supernatanten direkte til efterfølgende PCR-amplifikation.

* Væv bør skæres op så meget som muligt for at tillade lysis-reaktionen at forløbe mere jævnt.

**Inkubation ved 95°C i 15 minutter er generelt tilstrækkelig til de fleste PCR-behov. Hvis der kræves en større mængde DNA, eller prøven er svær at lysere, kan tiden forlænges til 30 min. Vævsblokken behøver ikke at være fuldstændig lyseret, og resten kan fjernes i et efterfølgende centrifugeringstrin.

Celle genomisk DNA-frigivelse

Efter at have dyrket transficerede celler i en 48-brønds plade i 3 dage og nået en celletæthed på omkring 70.000 celler/brønd, fjernes mediet så fuldstændigt som muligt. Tilsæt derefter 90 ul ML buffer direkte pr. brønd og pipetter hver brønd. Overfør alt til 96-brønds PCR-pladen. Efter behandling med en PCR-maskine ved 95 °C i 5-15 minutter og afkøling tilsættes 10 ul MT-buffer og blæses jævnt og grundigt. Brug high-fidelity-enzym (Cat# 10164) eller Taq-enzym, tilsæt 0,5-2 µl cellelysat til hver 50 µl PCR-reaktionssystem og udfør PCR.

Figur 1. Direkte PCR med cellelysat behandlet med 19697.

Noter

1. Dette produkt er kun til forskningsbrug.
2. Brug briller, laboratoriefrakker og engangshandsker for din sikkerhed.
3. For at undgå krydskontaminering mellem prøverne er det nødvendigt at nedsænke kanten af ​​prøveudtagningsanordningen eller den del, der er i direkte kontakt med prøven, i 2 % natriumhypochloritopløsning efter hver prøvetagning, vaske den flere gange og derefter tørre den resterende væske med et rent køkkenrulle, før det bruges igen.Af hensyn til testens bekvemmelighed kan flere prøveudtagningsanordninger klargøres og rengøres ensartet efter brug for at sikre, at hver enkelt prøve udtages med en kontamineringsfri prøveudtagningsanordning.
4. Det anbefales at bruge friskt taget dyrevæv. I tilfælde af langtidsfrosne væv bør gentagen frysning og optøning undgås så meget som muligt, da det ellers vil føre til nedbrydning af skabelonen og påvirke PCR-effektiviteten.

Dokumenter:

Manualer