Uspecifik amplifikation af Taq DNA-polymerase er et almindeligt problem i PCR-eksperimenter, som direkte påvirker fortolkningen af ​​detektionsresultater og kan føre til et fald i amplifikationsfølsomhed og endda en reduktion i udbyttet af målfragmentet. Anvendelse af enzymmodifikatorer til at forsegle det aktive center af Taq DNA-polymerase ved stuetemperatur, og derved hæmme DNA-polymeraseaktiviteten af ​​Taq-enzymet ved stuetemperatur, er i øjeblikket den mest effektive metode til at undertrykke uspecifik amplifikation. De dobbeltforseglede antistoffer udviklet af Yisheng forsegler ikke kun polymeraseaktiviteten af ​​Taq DNA-polymerase, men forsegler samtidig exonukleaseaktiviteten af ​​Taq DNA-polymerase. Denne dobbelte tilgang forhindrer effektivt uspecifik amplifikation forårsaget af fejlparring eller primerdimere og forhindrer også dannelsen af ​​uspecifikke signaler på grund af materialenedbrydning, hvorved specificiteten af ​​reagenset forbedres dobbelt. Dette gør det muligt for detektionsreagenser at klare transport eller brug ved stuetemperatur med lethed.

1.Ultrahøj amplifikationsspecificitet – Det dobbeltforseglede antistof kan samtidig forsegle både polymerase- og exonukleaseaktiviteter, hvilket effektivt undgår uspecifik amplifikation og øger specificiteten.

2.Enestående detektionsfølsomhed - Hot-start-formuleringen sikrer effektiv påvisning af gener med lav overflod, hvilket giver højere følsomhed.

3.Fremragende produktstabilitet - Stabil i ydeevne, når den placeres ved 37°C i 5 dage eller ved 4°C i 10 dage.

4.Grundlinjestabilitet og god linearitet – Løsning af problemet med basislinjedrift, hvilket resulterer i fremragende linearitet.

5.Hurtig frigivelse af enzymaktivitet – Over 95 % af enzymaktiviteten kan frigives ved opvarmning ved 95°C i 20 sekunder.

6.Bred anvendelighed af enzymer – Velegnet til både vildtype- og mutante Taq-enzymer, hvor hver mg antistof er i stand til at forsegle 4-10 KU Taq-enzym.

1 Blokering af Taq DNA polymerase exonuklease aktivitet

Syntetiske primerprober blev henholdsvis inkorporeret i reaktionsblandingerne af Taq DNA-polymerase, som enten var uforseglet eller forseglet med dobbeltlukkende antistoffer, og reaktionerne blev udført ved 40°C. Fluorescenssignalerne for begge blev påvist, og det blev fundet, at dobbeltlukningsantistofferne effektivt kan forsegle exonukleaseaktiviteten af ​​Taq DNA-polymerase.

Figur 2. Påvisning af forseglingseffektiviteten af ​​dobbeltforseglet antistof-endonukleaseaktivitet.

02 Verifikation af detektionsfølsomhed

Ved at bruge henholdsvis Yeasens dobbeltforseglede antistof og T Companys antistof til at forsegle Taq-enzym, efterfulgt af påvisning af positive prøver gennem ARMS-PCR-teknologi, blev det fundet, at Taq-enzymet forseglet af Yeasens dobbeltforseglede antistof var nøjagtigt i ARMS-PCR-amplifikation med højere følsomhed.

Rød:YEASEN antistof+Taq; Blå:leverandør A antistof+Taq.

Figur 3. Amplifikationskurve for ARMS-PCR.

03 Stabilitetsverifikation (4°C i 10 dage, 37°C i 5 dage).

Ved at bruge traditionelle lukkede antistoffer og dobbeltlukkede antistoffer til henholdsvis at blokere Taq DNA-polymerase, formuleres polymerasen derefter til en komplet forblandingsopløsning indeholdende primere og prober. Denne opløsning efterlades ved 4°C i 10 dage eller ved 37°C i 1, 3 og 5 dage og anvendes derefter til at amplificere 10.000 kopier af ASF-plasmidet. Det blev observeret, at der ikke var nogen signifikante ændringer i amplifikationskurverne og Ct-værdierne.

Figur 4. Amplifikationskurver for 10.000 kopier af ASF-plasmid efter at Taq-polymerase blev blokeret med traditionelt blokerende antistof (A) og dobbeltblokeret antistof (B), amplificeres af systemet med qPCR.

04 Baseline detektion

Under visse forhold, hvor specifikke primere bruges sammen med bestemte buffere og instrumenter, kan der forekomme et fænomen kendt som baseline-drift. Imidlertid kan brugen af ​​dobbeltlukkede antistoffer effektivt løse problemet med baseline-drift og derved lette en mere stabil baseline.

Figur 5. Amplifikationskurver for SARS-CoV-2 N-gen (A) og ACT-gen (B) i qPCR-analyse.

05 Linearitetsverifikation

Reaktionsblandingen forseglet med dobbeltlukkede antistoffer blev anvendt til at amplificere 100.000, 10.000, 1.000 og 100 kopier af ASFV/ACT-dobbeltplasmidet for at generere en standardkurve. Som det kan ses af figur 7, udviser begge god linearitet.

Figur 6. Standardkurvegrafer for ASFV-gen og ACT-gen genereret under anvendelse af en dobbeltblok reaktionsblanding.

06 Enzymatisk aktivitetsfrigivelsesanalyse

Ved at bruge de dobbeltlukkede antistoffer (Cat#31303) fra Yeasen til at forsegle Taq-enzym og underkaste det et termisk shock ved 95°C i 20 sekunder, blev den enzymatiske aktivitet påvist. Det kan observeres, at 31303 efter et 20 sekunders termisk shock ved 95°C kan frigive mere end 95 % af den enzymatiske aktivitet, hvilket er sammenligneligt med antistofferne fra Company T.

Tabel 1. Varmechok ved 95°C i 20 sekunder af enzymet.

07 Multiplex Taq Polymerase Detektion

Yeasens dobbeltlukkede antistoffer (Cat#31303) blev brugt til at forsegle tre typer Taq-polymeraser (vildtype + to mutanttyper), med et forseglingsforhold på 1μg til 5U, og fluorescensværdierne og forseglingseffektiviteten blev målt. Det blev fundet, at Yeasens dobbeltlukkede antistoffer (Cat#31303) for forskellige typer af Taq-polymeraser udviste gode forseglingseffekter.

Tabel 2. Blokeret effektivitet af forskellige typer Taq-polymerase.