Beskrivelse
Cell Counting Kit-8 (CCK-8) er et hurtigt og meget følsomt detektionskit baseret på WST-8 (2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazoliummononatriumsalt)-reagenset. WST-8 er et opgraderet reagens af MTT og kan reduceres til en meget vandopløselig orange-gul formazan ved hjælp af dehydrogenaser i mitokondrierne. Mængden af dannet formazan er proportional med antallet af levende celler. OD-værdien af formazan ved 450 nm detekteret af en mikropladelæser kan indirekte angive antallet af levedygtige celler. Dette kit bruges i vid udstrækning til lægemiddelscreening, celleproliferation og cytotoksicitetsassays, testning af tumorlægemiddelfølsomhed og aktivitetsdetektion af biologiske faktorer.
Fordele ved CCK-8 metoden
1. Sammenligning af CCK-8-metoden med andre metoder til påvisning af celleproliferation/toksicitet.
| Detektionsmetode | MTT metode | XTT metode | WST - 1 metode | CCK 8 metode |
|---|---|---|---|---|
| Vandopløselighed af formazan-produktet | Lav (skal tilsætte organisk opløsningsmiddel for at opløse og derefter teste) | Høj | Høj | Høj |
| Produktegenskaber | Pulver | 2 flasker opløsning | Løsning | 1 flaske opløsning |
| Brugsmetode | Bland i opløsning og brug | Opløsningen blev fremstillet lige før brug. | Ud af æsken | Ud af æsken |
| Detektionsfølsomhed | Høj | Meget høj | Meget høj | Høj |
| Opdagelse tid | Lang | Kort | Kort | Den korteste |
| Detektionsbølgelængde | 560-600 nm | 420-480 nm | 420-480 nm | 430-490 nm |
| cytotoksicitet | Høj toksicitet, fuldstændig forsvinden af cellemorfologi | Lav toksicitet, cellemorfologi uændret | Lav toksicitet, cellemorfologi uændret | Lav toksicitet, cellemorfologi uændret |
| Reagensstabilitet | Generel | Lav | Generel | Høj |
| Bulkprøvetestning | Gennemførlig | Passende | Passende | Passende |
2. Fenolrødt og serum forstyrrer ikke CCK-8-detektion.
3. Da cytotoksiciteten af CCK-8-reagens er meget lav, kan den optimale måletid bestemmes ved gentagne gange at aflæse med en mikropladelæser på forskellige tidspunkter efter tilsætning af CCK-8-reagens.
Forsendelse og opbevaring
Produktet kunne opbevares ved -25~-15ºC på et tørt og mørkt sted i to år.
Forholdsregler
1. I det første eksperiment anbefales det at bestemme det optimale antal udpladede celler og den optimale inkubationstid for CCK-8-reagens.
2. Brug om muligt en flerkanalspipette for at reducere variationer mellem replikatbrønde. Undgå bobler i eksperimentet, da bobler vil forstyrre OD-aflæsningen. Når CCK-8-reagenset tilsættes, anbefales det at tilføje det tæt på dyrkningspladens væg i stedet for at indsætte det i dyrkningsmediet.
3. Hvide blodlegemer kan kræve længere inkubationstid.
4. Ved brug af en standardplade med 96 brønde er antallet af udpladede celler mindst 1.000 celler/brønd (100 μL). Detektionsfølsomheden for hvide blodlegemer er relativt lav, så det anbefales at udplade mindst 2.500 celler/brønd (100 μL). Hvis du bruger en 24-brønds eller 6-brønds plade, skal du beregne det tilsvarende antal celler for hver brønd og tilsætte det passende volumen af CCK-8-reagens (volumenet af tilsat CCK-8-reagens er 10 % af volumenet af dyrkningsmediet i hver brønd på pladen).
5.Hvis 450 nm filteret ikke er tilgængeligt, kan et filter med absorbans mellem 430-490 nm bruges, men 450 nm filteret kan opnå den højeste detektionsfølsomhed.
6. Phenolrød påvirker ikke målingen, da absorbansen af phenolrød i mediet kan elimineres ved at fratrække absorbansen af blindgruppen.
7. For din sikkerhed og sundhed bedes du bære laboratoriefrakken og engangshandskerne, når du udfører eksperimentet.
Instruktioner
I. Lav en standardkurve
1. Forbered cellesuspensionen, bestem celletætheden, og plade celler.
2. Fortynd cellerne sekventielt med dyrkningsmediet i henhold til et bestemt forhold (såsom 1:2-forhold) for at danne en cellekoncentrationsgradient, generelt 3-5 cellekoncentrationsgradienter, 3-6 replikatbrønde for hver koncentration.
3. Efter udpladen dyrkes cellerne i 2-4 timer for at få dem til at klæbe. Tilsæt derefter CCK-8-reagenset, inkuber i et vist tidsrum og mål OD-værdien. Plot en standardkurve med cellenummeret som X-aksen og OD-værdien som Y-aksen. Ifølge denne standardkurve kan celletallet i en ukendt prøve bestemmes (forudsætningen for at bruge denne standardkurve er, at de eksperimentelle betingelser skal være konsistente).
II. Cellelevedygtighedsanalyse
1. Plads celler (100 μL/brønd) i en 96-brønds plade. Placer pladen i en inkubator (37°C, 5% CO2) i en periode til præinkubation.
2. Tilsæt 10 μL CCK-8-reagens til hver brønd (pas på ikke at indføre bobler i brøndene, da de interfererer med OD-aflæsningen) og bland forsigtigt.
3. Placer pladen i inkubatoren og inkuber i 1-4 timer.
4. Mål absorbansen ved 450 nm med en mikropladelæser.
5. Hvis OD-værdien ikke måles med det samme, tilsæt 10 μL 0,1 M HCl-opløsning eller 1 % w/v SDS-opløsning til hver brønd, dæk pladen og opbevar den med beskyttelse mod lys ved stuetemperatur. Absorbansværdien ændres ikke inden for 24 timer.
III. Celleproliferation og cytotoksicitet assay
1. Plads celler (100 μL/brønd) i en 96-brønds plade. Placer pladen i en inkubator (37°C, 5% CO2) i 24 timer til præinkubation.
2. Tilsæt 10 μL forskellige koncentrationer af stoffet, der skal testes, til pladen.
3. Placer pladen i inkubatoren og inkuber i et vist tidsrum (såsom 6, 12, 24 eller 48 timer).
4. Tilsæt 10 μL CCK-8-reagens til hver brønd (pas på ikke at indføre bobler i brøndene, da de forstyrrer OD-aflæsningen) og bland forsigtigt.
5. Placer pladen i inkubatoren og inkuber i 1-4 timer.
6. Mål absorbansen ved 450 nm med en mikropladelæser.
7. Hvis OD-værdien ikke måles med det samme, tilsæt 10 μL 0,1 M HCl-opløsning eller 1 % w/v SDS-opløsning til hver brønd, dæk pladen og opbevar den med beskyttelse mod lys ved stuetemperatur. Absorbansværdien ændres ikke inden for 24 timer.
Note: Hvis stoffet oxiderer eller reducerer, skal du erstatte det gamle dyrkningsmedium med frisk medium (fjern det gamle medium, vask cellerne to gange med frisk medium, og tilsæt derefter frisk medium), før du tilsætter CCK-8-reagenset for at eliminere virkningen af stoffet.Hvis stoffet selv kun har -en let effekt på absorbansværdien, er der ikke behov for at udskifte dyrkningsmediet, og virkningen af stoffet kan elimineres ved at fratrække absorptionsværdien af en blank gruppe med stoffet.
Beregningsformel
Celleoverlevelsesrate =[(AC) /(BC)] x100 %
Hæmningshastighed =[(BA) /(BC)] x100 %
A: Absorbansen af den eksperimentelle gruppe (absorbansen af dyrkningsmediet indeholdende celler, CCK-8-reagens og stoffet, der skal testes)
B: Kontrolgruppens absorbans (absorbansen af dyrkningsmediet indeholdende celler, CCK-8-reagens)
C: Absorbansen af blank gruppe (absorbansen af dyrkningsmediet indeholdende CCK-8 reagens)
Citater
[1] Sun L, Li P, Ju X, et al. I vivo strukturel karakterisering af SARS-CoV-2 RNA-genomet identificerer værtsproteiner, der er sårbare over for genbrugte lægemidler. Celle. 2021;184(7):1865-1883.e20. doi:10.1016/j.cell.2021.02.008(IF:41.584)
[2] Wei S, Zhao Q, Zheng K, et al. GFAT1-forbundet TAB1-glutamylering opretholder p38 MAPK-aktivering og fremmer lungekræftcelleoverlevelse under glucosesult. Cell Discov. 2022;8(1):77. Udgivet 9. august 2022. doi:10.1038/s41421-022-00423-0(IF:38.079)
[3] Chen X, Zhang D, Su N, et al. Visualisering af RNA-dynamik i levende celler med lyse og stabile fluorescerende RNA'er. Nat Biotechnol. 2019;37(11):1287-1293. doi:10.1038/s41587-019-0249-1(IF:31.864)
[4] Yang F, Xiao Y, Ding JH, et al. Ferroptose-heterogenitet i triple-negativ brystkræft afslører en innovativ kombinationsstrategi for immunterapi [publiceret online forud for tryk, 11. oktober 2022]. Celle Metab. 2022;S1550-4131(22)00411-9. doi:10.1016/j.cmet.2022.09.021(IF:31.373)
[5] Rong QX, Wang F, Guo ZX, et al. GM-CSF medierer immunundvigelse via opregulering af PD-L1-ekspression i ekstranodal naturlig dræber/T-cellelymfom. Mol Cancer. 2021;20(1):80. Udgivet 2021 29. maj. doi:10.1186/s12943-021-01374-y(IF:27.401)
[6] Xia B, Shen X, He Y, et al. SARS-CoV-2 kappeprotein forårsager akut respiratory distress syndrome (ARDS)-lignende patologiske skader og udgør et antiviralt mål. Cell Res. 2021;31(8):847-860. doi:10.1038/s41422-021-00519-4(IF:25.617)
[7] Yang X, Zhao X, Zhu Y, et al. FBXO34 fremmer latent HIV-1-aktivering ved post-transkriptionel modulering. Emerg Microbes Infect. 2022;11(1):2785-2799. doi:10.1080/22221751.2022.2140605(IF:19.568)
[8] Zhou Z, Zhang X, Lei X, et al.Sensing af cytoplasmatisk kromatin af cGAS aktiverer medfødt immunrespons i SARS-CoV-2-infektion. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):382. Udgivet 3. november 2021. doi:10.1038/s41392-021-00800-3(IF:18.187)
[9] Li M, Hao B, Zhang M, et al. Melatonin øger radiofrekvens-induceret NK-antitumor-immunitet, hvilket forårsager omprogrammering af kræftmetabolisme og hæmning af multipel lungetumorudvikling. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):330. Udgivet 1. september 2021. doi:10.1038/s41392-021-00745-7(IF:18.187)
[10] Qi S, Zhu Y, Liu X, et al. WWC-proteiner medierer LATS1/2-aktivering af Hippo-kinaser og indebærer en tumorundertrykkelsesstrategi. Mol Cell. 2022;82(10):1850-1864.e7. doi:10.1016/j.molcel.2022.03.027(IF:17.970)
[11] Zhu J, Li X, Cai X, et al. Argininmonomethylering af PRMT7 kontrollerer MAVS-medieret antiviral medfødt immunitet. Mol Cell. 2021;81(15):3171-3186.e8. doi:10.1016/j.molcel.2021.06.004(IF:17.970)
[12] Teng KX, Niu LY, Xie N, Yang QZ. Supramolekylære fotodynamiske midler til samtidig oxidation af NADH og generering af superoxidradikal. Nat Commun. 2022;13(1):6179. Udgivet 19. oktober 2022. doi:10.1038/s41467-022-33924-3(IF:17.694)
[13] Zhong J, Guo Y, Lu S, et al. Rationelt design af et følsomhedsforbedret sporstof til at opdage effektive APC-Asef-hæmmere. Nat Commun. 2022;13(1):4961. Udgivet 2022 24. august doi:10.1038/s41467-022-32612-6(IF:17.694)
[14] Liu F, Wang X, Duan J, et al. En Temporal PROTAC Cocktail-medieret sekventiel nedbrydning af AURKA ophæver Akut Myeloid Leukæmi-stamceller. Adv Sci (Weinh). 2022;9(22):e2104823. doi:10.1002/advs.202104823(IF:16.806)
[15] Ji C, Qiu M, Ruan H, et al. Transkriptomanalyse afslørede symbiosenichen i 3D-stilladser for at fremskynde heling af knogledefekter. Adv Sci (Weinh). 2022;9(8):e2105194. doi:10.1002/advs.202105194(IF:16.806)
[16] Feng L, Dou C, Xia Y, et al. Neutrofil-lignende cellemembran-coated nanozymterapi til iskæmisk hjerneskade og langsigtet neurologisk funktionel restitution. ACS Nano. 2021;15(2):2263-2280. doi:10.1021/acsnano.0c07973(IF:15.881)
[17] Wang Z, Gong X, Li J, et al. Iltleverende polyfluorcarbon-nanovehicles forbedrer tumoriltningen og styrker fotodynamisk medieret antitumorimmunitet. ACS Nano. 2021;15(3):5405-5419. doi:10.1021/acsnano.1c00033(IF:15.881)
[18] Jiang Z, He L, Yu X, et al. Antiangiogenese kombineret med hæmning af hypoxibanen letter lavdosis, røntgeninduceret fotodynamisk terapi [publiceret online forud for tryk, 25. juni 2021]. ACS Nano. 2021;10.1021/acsnano.1c01063. doi:10.1021/acsnano.1c01063(IF:15.881)
[19] Gong X, Li J, Xu X, et al. Mikrovesikel-inspireret ilt-leverende nanosystem potenserer stråleterapi-medieret modulering af tumorstroma og antitumorimmunitet. Biomaterialer. 2022;290:121855. doi:10.1016/j.biomaterials.2022.121855(IF:15.304)
[20] Deng J, Xu W, Lei S, et al. Aktiverede naturlige dræberceller-afhængige dendritiske celler rekruttering og modning af responsive nanogeler til målretning mod bugspytkirtelkræft-immunterapi. Lille. 2022;18(44):e2203114. doi:10.1002/smll.202203114(IF:15.153)
Betaling og sikkerhed
Dine betalingsoplysninger behandles sikkert. Vi gemmer ikke kreditkortoplysninger og har heller ikke adgang til dine kreditkortoplysninger.
Forespørgsel
Du kan også lide
FAQ
Produktet er kun til forskningsformål og er ikke beregnet til terapeutisk eller diagnostisk brug hos mennesker eller dyr. Produkter og indhold er beskyttet af patenter, varemærker og ophavsrettigheder ejet af Yeasen Biotechnology. Varemærkesymboler angiver oprindelseslandet, ikke nødvendigvis registrering i alle regioner.
Visse applikationer kan kræve yderligere tredjeparts intellektuelle ejendomsrettigheder.
Yeasen er dedikeret til etisk videnskab og mener, at vores forskning bør adressere kritiske spørgsmål og samtidig sikre sikkerhed og etiske standarder.