Annexin V-EGFP/PI-celleapoptosedetektionskit bruger EGFP-mærket Annexin V som en sonde til at detektere forekomsten af ​​tidlig celleapoptose.
Detektionsprincippet er som følger: i normale levende celler er phosphotidylserin (PS) placeret på indersiden af ​​cellemembranen, men i tidlige apoptotiske celler vender PS fra indersiden af ​​cellemembranen til overfladen af ​​cellemembranen og udsættes for det ekstracellulære miljø. Annexin-V er en Ca²⁺ -afhængigt phospholipid-bindende protein med en molekylvægt på 35 til 36 kDa, der binder til PS med høj affinitet. Fosfatidylserinen kan binde til membranen af ​​tidlige apoptotiske celler gennem den eksponerede fosfatidylserin på ydersiden af ​​cellen.
Derudover leveres Propidium Iodide (PI) for at skelne overlevende tidlige celler fra nekrotiske eller sene apoptotiske celler. PI er et nukleinsyrefarvestof, som ikke kan passere gennem den intakte cellemembran af normale celler eller tidlige apoptotiske celler, men kan passere gennem cellemembranen af ​​sene apoptotiske og nekrotiske celler og gøre kernen rød. Når Annexin V blev kombineret med PI, blev PI således udelukket fra levende celler (Annexin V^-/PI^-) og tidlige apoptotiske celler (Annexin V⁺/PI^-). De sene apoptotiske og nekrotiske celler var dobbelt positive for både EGFP og PI (Annexin V⁺/PI⁺).
Dette sæt er velegnet til flowcytometri og fluorescensmikroskopi.

Produktkomponenter

Forsendelse og opbevaring

Komponenterne leveres med en ispose og kan opbevares ved -20°C, undgå lys, og undgå gentagen frysning og optøning i 1 år.
[Noter]: Hvis det skal bruges gentagne gange i en kort periode, kan det opbevares ved 4 ℃ og beskyttes mod lys i et halvt år.

Forsigtig

1) Da apoptose er en hurtig proces, anbefales det, at prøver analyseres inden for 1 time efter farvning.
2) For adhærente celler er fordøjelsen et kritisk trin. Brug ikke EDTA i fordøjelsesopløsningen, da EDTA kan påvirke bindingen af ​​Annexin V til PS.
3) Annexin V-FITC, men ikke Annexin V-EGFP, bør bruges til at fiksere celler, såsom at detektere apoptose og cellecyklus på samme tid, fordi EGFP ville blive denatureret og miste sin evne til at excitere fluorescens under fiksering. Celler blev inkuberet med Annexin V-FITC før fiksering, og ubundet Annexin V-FITC blev vasket væk med bindingsbuffer.Fordi øget cellepermeabilitet under fiksering skaber cellerester, der kan binde sig til Annexin V og forstyrre resultaterne.
4) Hvis prøven er fra blod, skal du sørge for at fjerne blodplader fra blodet. Fordi blodplader indeholder PS, som kan binde til Annexin V, hvilket forstyrrer resultaterne. Blodplader kan vaskes væk ved at bruge et buffermiddel indeholdende EDTA og centrifugere ved 200 g.
5) Centrifuger venligst reagenset kort, før dækslet åbnes, og smid væsken på dækslets indervæg til bunden af ​​røret for at undgå væskedrys, når dækslet åbnes.
6) Annexin V-EGFP og PI er lysfølsomme stoffer, så undgå lys under drift.
7) Kun til forskningsbrug!

Instruktioner

Eksperimentdesign
Blankt rør: Negative kontrolceller uden Annexin V-EGFP og PI-farvningsopløsning blev brugt til spændingsregulering.
Enkeltfarvede rør: Positive kontrolceller, kun suppleret med Annexin V-EGFP, blev brugt til at modulere kompensation.
Detektionsrør: Cellerne blev behandlet med Annexin V-EGFP og PI-farvningsopløsning. De eksperimentelle data blev opnået ved at justere parametrene for det tomme rør og enkeltfarveglas.
1.1 Prøvefarvning
1) suspensionscelle: Celler blev opsamlet ved centrifugering ved 300 g i 5 minutter ved 4°C.
adhærent celle: Efter fordøjelse med trypsin uden EDTA blev celler høstet ved centrifugering ved 300 g i 5 minutter ved 4 ° C. Trypsinfordøjelsestiden bør ikke være for lang for at forhindre falske positiver.
2) Cellerne blev vasket med forafkølet PBS to gange, hver gang ved 300 g, og centrifugeret ved 4 ℃ i 5 min.
3) Cellerne blev resuspenderet med 1 x bindingsbuffer, og koncentrationen blev justeret til 1~5 x 106/ml.
4) 100 μL cellesuspension blev tilsat i 5 mL flowcytometrirør, 5 μl Annexin V-EGFP blev tilsat, og cellerne blev blandet og inkuberet i 5 minutter ved stuetemperatur under lys.
5) Tilsætning af 10 μl PI-opløsning og 400 μl PBS, farvningen blev udført med det samme.
[Noter]: Når der bruges flowcytometri til at detektere apoptose, påvirkes PI i høj grad af tid, og for lang tid vil føre til en stigning i PI-farvning, så flowcytometri bør afsluttes inden for 1 time.
1.2 Flowcytometrianalyse
Den maksimale excitationsbølgelængde for EGFP var 488 nm, og den maksimale emissionsbølgelængde var 507 nm; Den maksimale excitationsbølgelængde af PI-DNA-komplekset var 535 nm, og den maksimale emissionsbølgelængde var 615 nm. Software såsom CellQuest blev brugt til analyse og et tofarvet prikplot blev tegnet, EGFP er abscissen og PI er ordinaten. Indsaml 10.000 hændelser pr. prøve. I et typisk eksperiment kan cellerne opdeles i tre undergrupper, levende celler har kun meget lav intensitet baggrundsfluorescens, tidlige apoptotiske celler har kun stærk grøn fluorescens, og sene apoptotiske celler har grøn og rød fluorescens dobbeltfarvning.