Detektionsprincippet for Annexin V-Alexa Fluor488/PI apoptosedetektionskit er som følger: i normale levende celler er phosphotidylserin (PS) placeret på indersiden af ​​cellemembranen, men i tidlige apoptotiske celler vender PS fra indersiden af ​​cellemembranen til overfladen af ​​cellemembranen og er det eksponerede cellemiljø. Annexin-V er en Ca²⁺ -afhængigt phospholipid-bindende protein med en molekylvægt på 35 til 36KD, som binder med høj affinitet til PS og binder til cellemembranen af ​​tidlige apoptotiske celler gennem phosphatidylserin eksponeret på ydersiden af ​​cellen.
Derudover leveres Propidium Iodide (PI) for at skelne overlevende tidlige celler fra nekrotiske eller sene apoptotiske celler. PI er et nukleinsyrefarvestof, som ikke kan passere gennem den intakte cellemembran af normale celler eller tidlige apoptotiske celler, men kan passere gennem cellemembranen af ​​sene apoptotiske og nekrotiske celler og gøre kernen rød. Når Annexin V blev kombineret med PI, blev PI således udelukket fra levende celler (Annexin V^-/PI^-) og tidlige apoptotiske celler (Annexin V⁺/PI^-). I modsætning hertil var sene apoptotiske og nekrotiske celler dobbelt positive for Alexa Fluor488 og PI (Annexin V⁺/PI⁺).

Produktkomponenter

Forsendelse og opbevaring

Komponenterne leveres med en ispose og kan opbevares ved -20°C i 1 år.

Forsigtig

1) Da apoptose er en hurtig proces, anbefales det, at prøver analyseres inden for 1 time efter farvning.
2) For adhærente celler er fordøjelsen et kritisk trin. Brug ikke EDTA i fordøjelsesopløsningen, da EDTA kan påvirke bindingen af ​​Annexin V til PS.
3) Hvis prøven er fra blod, skal du sørge for at fjerne blodplader fra blodet. Fordi blodplader indeholder PS, som kan binde til Annexin V, hvilket forstyrrer resultaterne. Et buffermiddel indeholdende EDTA kan anvendes, og blodpladerne vaskes væk ved centrifugering ved 200 g.
4) Centrifuger venligst reagenset kort, før dækslet åbnes, og smid væsken på dækslets indervæg til bunden af ​​røret for at undgå væskedrys, når dækslet åbnes.
5) Annexin V-Alexa Fluor488 og PI er lysfølsomme stoffer og bør holdes væk fra lys under håndtering.
6) Kun til forskningsbrug!

Instruktioner

1.1 Prøvefarvning
1.a) suspensionscelle: Celler blev opsamlet ved centrifugering ved 300 g i 5 minutter ved 4°C.
b) adhærent celle: Efter fordøjelse med trypsin uden EDTA blev celler høstet ved centrifugering ved 300 g i 5 minutter ved 4 °C. Trypsinfordøjelsestiden bør ikke være for lang for at forhindre falske positiver.
2. Cellerne blev vasket to gange med PBS forafkølet ved 4°C, hver gang under anvendelse af 300 g, og centrifugeret ved 4°C i 5 minutter.
3. Celler blev resuspenderet ved at tilsætte 250 μL 1×bindende buffer, og koncentrationen blev justeret til 1×106/ml.
4. 100 μL cellesuspension blev tilsat i et 5 mL flowcytometrirør, 5 μL Annexin V-Alexa Fluor 488 og 10 μL PI blev tilsat og blandet forsigtigt.
5. Reaktionen blev holdt væk fra lys og holdt ved stuetemperatur i 15 min.
6. 400 μL 1×bindende buffer blev tilsat, blandet, og prøverne blev påvist ved flowcytometri inden for 1 time.
[Noter]: For at undgå celletab under cellevask kan en lille spids bruges til at aspirere væske.
1.2 Flowcytometrianalyse
Alexa Fluor488 har en maksimal excitationsbølgelængde på 488 nm og en maksimal emissionsbølgelængde på 519 nm; Den maksimale excitationsbølgelængde af PI-DNA-kompleks var 535 nm, og den maksimale emissionsbølgelængde var 615 nm. CellQuest og anden software blev brugt til at analysere og tegne et tofarvet prikplot med Alexa Fluor488 som abscisse og PI som ordinat. Indsaml 10.000 hændelser pr. prøve.
1.3 Fluorescensmikroskopianalyse
1) Drop en dråbe af cellesuspensionen dobbeltfarvet med Annexin V-FITC/PI på objektglasset og dæk cellerne med et dækglas.
2) Det blev observeret under et fluorescensmikroskop med et tofarvet filter. Annexin V-FITC-fluorescenssignalet var grønt, og PI-fluorescenssignalet var rødt.