Når celler gennemgår apoptose, aktiverer de endonuklease-enzymer, der skærer det genomiske DNA mellem nukleosomer. Efter at DNA var blevet ekstraheret under apoptose, kunne en 180-200 bp DNA-stige findes.
TUNEL (TdT-medieret dUTP Nick End Labeling) Apoptosedetektionskit (Alexa Fluor 640) kan bruges til at detektere nuklear DNA-fragmentering i den sene apoptotiske proces af vævsceller. Princippet er, at under påvirkning af Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT), er Alexa Fluor 640-12-DUTP inkorporeret i 3'-hydroxyl (3'-OH) Terminalen, der eksponeres under genomisk DNA-brud. Det kan således påvises ved fluorescensmikroskopi eller flowcytometri. Alexa Fluor 640 er et rødt fluorescerende farvestof med høj stabilitet og stærk lysstyrke.
Dette kit har en bred vifte af anvendelser og kan bruges til at detektere apoptose i frosne eller paraffinsektioner såvel som i dyrkede adhærente eller suspenderede celler.

Produktkomponenter

Forsendelse og opbevaring

Komponenterne leveres med en ispose og kan opbevares ved -20°C i 1 år.

Forsigtig

1. Det er nødvendigt at forberede din egen PBS til vask af celler, en anti-fluorescens quenching opløsning til forsegling af tabletter og 4% paraformaldehyd til fiksering. Leukocytter skal muligvis dyrkes i lang tid.
2. Kun til forskningsbrug!

Instruktioner

1. Prøveforberedelsen
1.1 Paraffinindlejrede vævssnit
1.1.1. Paraffinvævssnittene blev nedsænket i xylen i 5 minutter ved stuetemperatur og gentaget én gang for at fjerne paraffin grundigt.
1.1.2.Læg sektionerne i blød i 100% ethanol i 5 minutter ved stuetemperatur og gentag én gang.
1.1.3. Ved stuetemperatur blev prøverne gennemblødt med gradientethanol (90, 80, 70%) i 3 minutter hver gang.
1.1.4. Skyl sektionerne forsigtigt med PBS, og dup forsigtigt den overskydende væske rundt om prøven på objektglassene med filterpapir. I dette tilfælde kan paraffinpennen eller den hydrofobe pen bruges til at tegne omridset af prøvefordelingen rundt om prøven, hvilket er praktisk til nedstrøms permeabilitetsbehandling og balancemærkningsoperation. Lad ikke prøven tørre under forsøget. Læg den behandlede prøve i den våde boks for at holde prøven våd.
1.1.5.2 mg/mL Proteinase K-opløsning blev fortyndet med PBS i et forhold på 1:100 for at nå en slutkoncentration på 20 μg/mL.
1.1.6.100 μL Proteinase K-opløsning i en koncentration på 20 μg/mL blev tilsat til hver prøve for fuldstændigt at dække den og inkuberet ved stuetemperatur i 20 min.
[Noter]: Proteinase K hjælper væv og celler med at blive permeable for farvningsreagenserne i efterfølgende trin. For lang inkubationstid vil øge risikoen for, at vævssnit falder af bærepladen i efterfølgende vasketrin, mens for kort inkubationstid kan forårsage utilstrækkelig permeabilitetsbehandling og påvirke mærkningseffektiviteten. For at opnå bedre resultater kan det være nødvendigt at optimere inkubationstiden for Proteinase K.
1.1.7. Skyl prøven 2-3 gange med PBS-opløsning, fjern forsigtigt overskydende væske, og dup forsigtigt væsken rundt om prøven på objektglasset med filterpapir. Den behandlede prøve anbringes i en våd boks for at holde prøven fugtig.
1.2 Frosset vævssnit
1.2.1. Fjern frosne sektioner og vend tilbage til stuetemperatur. Objektglassene blev nedsænket i 4% paraformaldehydopløsning (opløst i PBS) og fikseret og inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur.
1.2.2. Fjern forsigtigt overskydende væske, og brug filterpapir til forsigtigt at duppe den overskydende væske rundt om prøven på objektglasset.
1.2.3. Objektglassene blev nedsænket i PBS-opløsning, inkuberet ved stuetemperatur i 15 minutter og vasket med PBS igen 2 gange i alt.
1.2.4. Fjern forsigtigt overskydende væske, og aftør forsigtigt objektglasset med filterpapir for at fjerne overskydende væske omkring prøven. I dette tilfælde kan paraffinpennen eller den hydrofobe pen bruges til at tegne omridset af prøvefordelingen rundt om prøven, hvilket er praktisk til nedstrøms permeabilitetsbehandling og balancemærkningsoperation. Under eksperimentet, lad ikke prøven tørre, og anbring den behandlede prøve i den våde boks for at holde prøven våd.
1.2.5. 2 mg/mL Proteinase K-opløsning blev fortyndet med PBS i et forhold på 1:100 for at nå en slutkoncentration på 20 μg/mL.
1.2.6. 100 μL Proteinase K-opløsning i en koncentration på 20 μg/mL blev tilsat til hver prøve for fuldstændigt at dække den og inkuberet ved stuetemperatur i 10 minutter.
[Noter]: Proteinase K hjælper væv og celler til at være permeable for farvningsreagenser i efterfølgende trin. For lang inkubationstid vil øge risikoen for, at vævssnit falder af bærepladen i efterfølgende vasketrin, mens for kort inkubationstid kan forårsage utilstrækkelig permeabilitetsbehandling og påvirke mærkningseffektiviteten. Det kan være nødvendigt at optimere inkubationstiden for Proteinase K, hvis der ikke blev opnået bedre resultater.
1.2.7. Skyl prøven 2-3 gange i et åbent bægerglas indeholdende PBS-opløsning.
[Noter]: For at undgå tab af prøveafskalning i rensetrinnet, anbefales det ikke at vaske flasken, men at lægge glassene i PBS-opløsning 2-3 gange til rengøring.
1.2.8. Fjern forsigtigt overskydende væske og brug filterpapir til forsigtigt at duppe væsken rundt om prøven på objektglasset.Den behandlede prøve anbringes i en våd boks for at bevare prøvens fugt.
1.3 Udarbejdelse af celle-crawl-ark
Vedhæftende celler blev dyrket på Lab-Tek Chamber Slides. Efter apoptoseinduktionsbehandling blev objektglassene vasket to gange med PBS.
1.4 Forberedelse af celleudstrygninger (ved at tage polylysin-coatede objektglas som eksempel)
1.4.1. Cellerne blev resuspenderet i PBS i en koncentration på ca. 2 x 107 celler/ml, 50-100 μL af cellesuspensionen blev aspireret på poly-lysin-coatede objektglas, og cellesuspensionen blev forsigtigt spredt åben med et rent objektglas.
1.4.2. Cellerne blev fikseret, og objektglassene blev nedsænket i en farvningstank indeholdende 4% frisklavet paraformaldehyd i PBS og anbragt ved 4°C i 25 minutter.
1.4.3. Objektglassene blev vasket, nedsænket i PBS og efterladt ved stuetemperatur i 5 min. Vask igen med PBS.
1.4.4. Fjern forsigtigt overskydende væske, og aftør forsigtigt objektglasset med filterpapir for at fjerne overskydende væske omkring prøven. I dette tilfælde kan en paraffinpen eller hydrofob pen bruges til at skitsere fordelingen af ​​prøven omkring prøven for at lette nedstrøms permeabilitetsbehandling og balancemærkningsoperationer. Under eksperimentet, lad ikke prøven tørre, og anbring den behandlede prøve i den våde boks for at holde prøven våd.
1.4.5. 2 mg/mL Proteinase K-opløsning blev fortyndet med PBS i et forhold på 1:100 for at nå en slutkoncentration på 20 μg/mL.
1.4.6. 100 μL Proteinase K-opløsning i en koncentration på 20 μg/mL blev tilsat til hver prøve for at gøre den helt dækket og inkuberet ved stuetemperatur i 5 minutter (den kan også nedsænkes i 0,2 % Triton X-100-opløsning fremstillet i PBS og inkuberes ved stuetemperatur i 5 minutter til permeabilitetsbehandling).
[Noter]: Proteinase K hjælper væv og celler til at være permeable for farvningsreagenser i efterfølgende trin. For lang inkubationstid vil øge risikoen for, at vævssnit falder af bærepladen i efterfølgende vasketrin, mens for kort inkubationstid kan forårsage utilstrækkelig permeabilitetsbehandling og påvirke mærkningseffektiviteten. Det kan være nødvendigt at optimere inkubationstiden for Proteinase K, hvis der ikke blev opnået bedre resultater.
1.4.7. Skyl prøven 2-3 gange med PBS, fjern forsigtigt overskydende væske, og dup forsigtigt væsken rundt om prøven på objektglasset med filterpapir. De behandlede prøver blev anbragt i en våd boks.
2. Trin til DNase-behandling af positive kontroller
Efter prøvegennemtrængning, celler blev behandlet med DNase I for at fremstille positive kontrolobjektglas. Denne proces forårsager normalt de fleste af cellerne behandlet for at vise grøn fluorescens.
[Noter]: Dnase I-behandling af immobiliserede celler forårsager brud af kromosomalt DNA, hvilket producerer mange 3'-ender af DNA, der kan mærkes.
2.1.Fortynd 10×DNase I-buffer med deioniseret vand i et forhold på 1:10 (200 µL 1× DNase I-buffer er påkrævet for hver prøve, dvs. 20 µL 10× DNase I-buffer og 180 µL deioniseret vand er påkrævet til fortynding). En dråbe på 100 µl blev tilsat til den permeable prøve og inkuberet i 5 minutter ved stuetemperatur. Tilsæt 1 μL DNase I (1U/μL) til de resterende 100 μL 1×DNase I-buffer for at opnå en slutkoncentration på 10 U/mL.
2.2. Væsken blev forsigtigt tappet af, derefter blev 100 μL buffer indeholdende 10 U/mL DNase I tilsat og inkuberet i 10 minutter ved stuetemperatur.
2.3. Bank på objektglasset for at fjerne overskydende væske, og vask objektglasset grundigt 3-4 gange i en farvetank med deioniseret vand.
[Noter]: En separat farvningstank skal bruges til de positive kontrolobjektglas, ellers kan resterende DNase I på de positive kontrolobjektglas introducere en høj baggrund på de eksperimentelle objektglas.
3. Mærkning og detektion
3.1.Equilibration Buffer (5 x Equilibration Buffer) fortyndes med deioniseret vand i et forhold på 1:5 (100 μL 1 x Equilibration Buffer er påkrævet for hver prøve).
3.2. Equilibration Buffer (100 μL 1× Equilibration Buffer) blev tilsat til hver prøve for fuldstændigt at ækvilibrere området og inkuberet i 10-30 minutter ved stuetemperatur. Skub alternativt ind i et kar med 1 x ækvilibreringsbuffer for at sikre, at objektglassene ikke ækvilibrerer prøven. Optø Alexa Fluor 640-12-dUTP-mærkning Bland på is, mens cellerne afbalanceres, og klargør nok TdT-inkubationsbuffer til alle eksperimenter og valgfri positive kontrolreaktioner i henhold til tabel 1. For en standardreaktion med et areal på mindre end 5 cm2 er volumenet 50 μl, og 50 μl multipliceres med det samlede T-positive kontrolvolumen for at bestemme T-positive kontrolvolumen. inkubationsbuffer påkrævet. For prøver med større overfladearealer kan reagensvolumenet øges proportionalt.

Tabel 1. TdT-inkubationsbuffere forberedt til eksperimenter og eventuelle positive kontrolreaktioner

[Negativt kontrolsystem]: En kontrolinkubationsbuffer uden TdT-enzymet blev fremstillet, og TdT-enzymet blev erstattet med ddH2O.
3.3. Det meste af de 100 μL 1 × Equilibration Buffer blev vasket af med absorberende papir omkring det ækvilibrerede område, og derefter blev 50 μLTdT inkubationsbuffer tilsat til et 5 cm2 område af celler. Lad ikke cellerne tørre ud. Herefter skal rutsjebanen være afskærmet mod lys.
3.4. Læg et plastikdækglas over cellerne for at sikre en jævn fordeling af reagenserne, og læg et papirhåndklæde fugtet med vand i bunden af ​​den våde boks. Objektglassene blev anbragt i en våd boks og inkuberet ved 37°C i 60 min. Pak den våde boks ind i aluminiumsfolie for at beskytte den mod lys.
[Noter]: Plastdækglasset kan skæres i to før brug. Fold kanten af ​​dækglasset for nem fjernelse og manipulation.
3.5. Plastdækglasset blev fjernet, og sektionerne blev inkuberet i PBS-opløsning ved stuetemperatur i 5 min. Derefter blev sektionerne vasket to gange med frisk PBS.
3.6. Tør forsigtigt PBS-opløsningen rundt og på bagsiden af ​​prøven med filterpapir.
[Noter]: For at reducere baggrunden, efter vask af objektglassene med PBS én gang, kan de vaskes med PBS indeholdende 0,1 % Triton X-100 og 5 mg/ml BSA 3 gange, 5 minutter hver gang, så de frie ureagerede markører kan være klare og rene.
3.7. Prøver blev farvet i en farvningstank, og objektglassene blev nedsænket i en farvningstank indeholdende PI-opløsning (1 μg/ml, frisklavet og fortyndet med PBS) i mørke og efterladt ved stuetemperatur i 5 min. (Valgfrit): Prøver blev farvet i en farvningstank, og objektglassene blev nedsænket i en farvningstank indeholdende DAPI-opløsning (2 μg/mL, frisklavet og fortyndet med PBS) i mørke og efterladt ved stuetemperatur i 5 min.
3.8.Vask prøven, nedsænk objektglasset i deioniseret vand og lad det stå ved stuetemperatur i 5 minutter. Gentag to gange for i alt tre vaske.
3.9. Det overskydende vand på objektglasset blev banket tørt, og 100 μl PBS blev tilsat til prøveområdet for at holde prøven fugtig.
3.10. Prøver blev straks analyseret under et fluorescensmikroskop, Alexa Fluor 640 rød fluorescens blev detekteret ved 620 nm og blå DAPI blev observeret ved 460 nm. DAPI kunne farve både apoptotiske og ikke-apoptotiske celler blå, og kun i apoptotiske kerner var Alexa Fluor 640-12-dUTP inkorporeret og lokaliseret rød fluorescens. Om nødvendigt kan objektglassene opbevares natten over ved 4 ° C i mørke.
4. Suspensionscellerne blev detekteret ved flowcytometri
4.1. 3~5x106 celler blev vasket to gange med PBS ved centrifugering (300xg) ved 4°C, centrifugeret ved 300 g ved 4°C i 10 minutter og derefter resuspenderet i 0,5 ml PBS.
4.2. Cellerne blev fikseret, og 5 ml 1% paraformaldehyd-opløsning fremstillet i PBS blev tilsat og anbragt på is i 20 minutter.
4.3. Celler blev centrifugeret ved 300 x g ved 4°C i 10 minutter, og supernatanten blev fjernet og resuspenderet i 5 ml PBS. Vasken blev gentaget én gang, og cellerne blev resuspenderet med 0,5 ml PBS.
4.4. Cellerne blev gennemtrængt, og 5 ml is-forafkølet 70% ethanol blev tilsat og inkuberet ved -20°C i 4 timer. Cellerne kunne opbevares i 70 % ethanol ved -20 ℃ i en uge, eller cellerne kunne være permeable med 0,2 % Triton X-100 opløsning fremstillet i PBS og opbevaret ved stuetemperatur i 5 minutter.
4.5. Celler blev centrifugeret ved 300 x g i 10 minutter og resuspenderet i 5 ml PBS. Centrifugering blev gentaget og resuspenderet i 1 ml PBS.
4.6. Overfør 2 × 106 celler til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
4.7. Ækvilibrering blev centrifugeret ved 300 x g i 10 minutter, og supernatanten blev fjernet og resuspenderet med 80 μL 1 x ækvilibreringsbuffer. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
4.8. Mens cellerne blev afbalanceret, blev Alexa Fluor 640-12-dUTP Labeling Mix smeltet på is, og en tilstrækkelig mængde TdT-inkubationsbuffer til alle reaktioner blev fremstillet i henhold til tabel 1. For en standardreaktion på 2 × 106 celler var volumenet 50 μL, og 50 μL blev multipliceret med det totale antal af reaktionsbuffer, der var påkrævet T.
4.9. Cellerne blev centrifugeret ved 300 x g i 10 minutter, supernatanten blev fjernet, og præcipitatet blev resuspenderet i 50 μL TdT-inkubationsbuffer og inkuberet ved 37 ℃ i 60 minutter, afskærmet fra lys. Celler blev forsigtigt resuspenderet hvert 15. minut med en mikropipette.
4.10. Reaktionen blev afsluttet ved tilsætning af 1 ml 20 mM EDTA og forsigtig blanding med en mikropipette.
4.11. Efter centrifugering ved 300 g i 10 minutter blev supernatanten kasseret, og præcipitatet blev resuspenderet i 1 ml 0,1 % Triton X-100-opløsning fremstillet i PBS, indeholdende 5 mg/ml BSA. Opløsningen blev gentaget én gang og vasket to gange i alt.
4.12. Celler blev analyseret ved flowcytometri, og Alexa Fluor 640 rød fluorescens ved 620 nm blev målt.