Beskrivelse
MycAway™ Mycoplasma qPCR Detection Kit er et produkt designet til kvalitativ påvisning af mycoplasma-kontamination i forskellige kilder, herunder råmaterialer, cellebanker, virusfrø, virale eller cellehøstløsninger og celler, der blandt andet anvendes i kliniske behandlinger. Dette kit bruger Taqman fluorescerende prober (FAM og VIC) og anvender Multiple polymerase chain reaction (PCR) teknikker til separat at detektere målet og intern kontrol. Det er blevet valideret for specificitet, detektionsgrænse og robusthed i henhold til EP <2.6.7> standarder, hvilket viser høj sensitivitet, specificitet, effektivitet og sikkerhed. Detektionsgrænsen er lig med eller under 10 CFU/mL.
Til nukleinsyreekstraktion kan dette produkt bruges sammen med MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit (Cat#18461), som anvender manuelle ekstraktionsmetoder. Alternativt kan nukleinsyrer i prøver ekstraheres automatisk ved hjælp af AutoPure 32A automatisk nukleinsyreekstraktor (Cat#80501) og MolPure® Mag32 Residual DNA Sample Preparation Kit FA (Cat#18462). Det er vigtigt at bemærke, at kits indeholdende Cat#18461 og Cat#40619 har gennemgået en omfattende validering; for detaljerede valideringsoplysninger, kontakt venligst vores tekniske support. Efter forbehandling af prøverne for at fjerne forstyrrende urenheder og opnåelse af oprensede nukleinsyrer, udføres en qPCR-reaktion ved hjælp af en realtids-PCR-forstærker, og fluorescenssignalet fra proben opsamles og analyseres.
| Kat.nr. | 40619ES25 / 40619ES60 |
| Størrelse | 25 T / 100 T |
| Opdagelse Begrænse | 10 CFU/ml |
| Opdage metode | qPCR metode (Taqman fluorescerende) |
| Varighed | 4 timer |
| Fluorescerende sonde | FAM (Mål kanal)；VIC (Indre kanal) |
| Overdækket mycoplasma | ≥ 100 |
| Validering | Valideret ifølge til EP <2.6.7> |
Komponenter
| Komponenter nr. | Navn | 40619ES25 | 40619ES60 |
| 40619-A | 4×MyqPCR-reaktionsbuffer | 250 μL | 1 ml |
| 40619-B | MyPrimer & Probe BLANDE | 25 μL | 100 μL |
| 40619-C* | Intern kontrol (IC) | 25 μL | 100 μL |
| 40619-D** | Positiv kontrol (PC) | 500 μL | 2 ml |
| 40619-E*** | DNA Fortynding buffer | 1 ml | 4×1 ml |
| 40619-F**** | Ultrarent vand | 500 μL | 2×1 ml |
*IC: Intern kontrollere;
**STK: Positiv kontrollere løsning ,de koncentration er 1.000 kopier/µL.
***DNA Fortynding buffer: brugt for IC fortynding og de skabelon af NTC og NCS.
****Ultrapure vand: brugt for de forberedelse af qPCR Blande.
Opbevaring
Dette produkt skal opbevares ved -25~-15 ℃ i 2 år.
*Ved modtagelse af sættet skal du kontrollere, om alle komponenter er komplette, og straks opbevare dem i -25~-15℃ tilstand, hvis ikke udføre analysen med det samme. Bemærk venligst 40619-B skal opbevares væk fra lys.
Instruktioner
- Forberedelser før forsøg
1) Forbered de nødvendige reagenser og materialer, som skal bruges i eksperimentet.
2）Bekræft egnetheden af qPCR-instrumentet
Dette sæt kan bruges på typerne af qPCR-instrumenter som nedenfor:
- Bio-Rad: CFX96
- Thermo Scientific: 7500 Real-Time PCR System；QuantStudio™5；
- Eksperiment metode
1) DNA-ekstraktion
Vi anbefaler at bruge ' Magnetisk resterende DNA-prøveforberedelseskit' (Kat #18461ES for manuel udsugning og Kat #18462ES til automatisk udsugning) for DNA ekstraktion, du kan besøg ' http:/www.yeasenbiotech.com ' for de
detaljerede oplysninger og indkøb.
Sættet (Cat#40619ES) indeholder en intern kontrol (IC). Hvis IC tilføjes til prøverne før DNA-ekstraktion, kan det verificere den komplette proces (inkluderet DNA-ekstraktion og qPCR-reaktion). Hvis tilføje IC til qPCR master mix
direkte, IC-enheden fungerer kun som en qPCR-kontrol.
2）qPCR-blandingsforberedelse
- Ifølge prøvemængden, som inkluderede positiv kontrol (PCS), ingen skabelonkontrol (NTC), negativ kontrolopløsning (NCS) og testprøve (TS) for at beregne antallet af reaktioner. Forbered 2 reaktioner parallelt til
hver prøve i generelt.
* PCS: Positiv kontrollere løsning；NTC: Nej skabelon kontrol；NCS: negativ kontrollere løsning；TS：Test prøve. Der er ingen behov til udføre
de prøve udvinding for PCS og NTC, men NCS og TS er nødvendige.
Reaktionsbrønde（M1）=（1×NCS + N×TS） ×2
Reaktionsbrønde（M2）=（1×PCS + 1×NTC） ×2
Reaktionsbrønde（M3）=（1×PCS + 1×NTC+ N×TS） ×2
- Foroptøn den nødvendige mængde reagenser på is i henhold til eksperimentdesignet og tabellerne nedenfor.
- Beregn mængden af qPCR Mix i henhold til antallet af reaktioner. Bemærk venligst, at hvis kittet vil blive brugt til GMP-aktiviteter såsom produktfrigivelse, anbefalede vi brugt tabel 1 og 2 til forberedelsen; Hvis sættet vil lige bruges til forskning, og der er ingen grund til at tilføje IC før ekstraktion efter evalueringen, følg derefter tabel 3 for
forberedelsen. Bemærk venligst, at ikke alle M1, M2 og M3 er havde brug for være forberede.
| Komponent | Volumen（1×40μL reaktioner） | Volumen (M1×40μL) |
| 4× MyqPCR-reaktionsbuffer | 10 μL | (M1+2) × 10 μL |
| MyPrimer & Probe BLANDE | 1 μL | (M1+2) ×1 μL |
| ROX | 0,8 μL /0 μL** | (M1+2) × 0,8 μL /0 μL |
| Renset vand | Op til 20 μL | Op til (M1+2) × 20 μL |
| Total | 20 μL | (M1+2) × 20 μL |
Tabel 1 qPCR Mix-system til M1
*De konfiguration system i Tabel 1 er baseret på de præmis at IC er tilføjet før udvinding for begge NCS og TS, altså det er ikke nødvendig
til tilføje IC når qPCR Blande forberedelse. IC tilføjer metode før udvinding: For det første, fortynd IC ved 20 gange med DNA fortyndingsmiddel, og tilføje 1 μL
fortyndet IC til hver 100 μL prøve prøve for de længere udvinding.
**Denne sæt gør ikke indeholde ROX Reference Farvestof. Hvis ROX reference farvestof er nødvendige for de Ægte Tid PCR forstærkere at du er for tiden bruger, 50×ROX Reference Farvestof (Kat#10200ES) er anbefales for bruge. I denne sagen, den tilføjet bind er 0,8 μL, som vist i Tabel 1. Hvis bruger andre
mærker af ROX produkter, tak henvise til deres instruktioner for ROX tilføjelse.Hvis ingen ROX reference farvestof er påkrævet, den tilføjet bind er 0 μL.
| Komponent | Volumen（1×40μL reaktioner） | Volumen (M2×40μL) |
| 4× MyqPCR-reaktionsbuffer | 10 μL | (M2+2) × 10 μL |
| MyPrimer & Probe BLANDE | 1 μL | (M2+2) ×1 μL |
| Intern kontrol（IC） | 1 μL* | (M2+2) ×1 μL /0 μL |
| ROX | 0,8 μL /0 μL** | (M2+2) × 0,8 μL /0 μL |
| Oprenset vand | Op til 20 μL | Op til (M2+2) × 20 μL |
| Total | 20 μL | (M2+2) × 20 μL |
Tabel 2 qPCR Mix-system til M2
*De konfiguration system i Tabel 2 er baseret på de præmis at IC er ikke tilføjet i PCS og NTC før udvinding, så IC behov til være tilføjet under qPCR Blande forberedelse. IC tilføjer metode efter udvinding: Udvande IC ved 100 gange med DNA fortyndingsmiddel og tilføje 1 μL fortyndet IC til
hver qPCR Blande system.
**Denne sæt gør ikke indeholde ROX Reference Farvestof. Hvis ROX reference farvestof er nødvendige for de Ægte Tid PCR forstærkere at du er for tiden bruger, 50×ROX Reference Farvestof (Kat#10200ES) er anbefales for bruge. I denne sagen, den tilføjet bind er 0,8 μL, som vist i Tabel 1. Hvis bruger andre
mærker af ROX produkter, tak henvise til deres instruktioner for ROX tilføjelse. Hvis ingen ROX reference farvestof er påkrævet, den tilføjet bind er 0 μL.
| Komponent | Volumen（1×40μL reaktioner） | Volumen (M3×40μL) |
| 4× MyqPCR-reaktionsbuffer | 10 μL | (M3+2) × 10 μL |
| MyPrimer & Probe BLANDE | 1 μL | (M3+2) ×1 μL |
| Intern kontrol（IC） | 1 μL* | (M3+2) ×1 μL /0 μL |
| ROX | 0,8 μL /0 μL** | (M3+2) × 0,8 μL /0 μL |
| Oprenset vand | Op til 20 μL | Op til (M3+2) × 20 μL |
| Total | 20 μL | (M3+2) × 20 μL |
Tabel 3 qPCR Mix-system til M3
*De konfiguration system i Tabel 3 er baseret på de præmis at IC er ikke tilføjet til prøver før udvinding, altså IC behov til være tilføjet under qPCR Blande forberedelse. IC tilføjer metode efter udvinding: Udvande IC ved 100 gange med DNA fortyndingsmiddel og tilføje 1 μL til hver qPCR Blande
system.
**Denne sæt gør ikke indeholde ROX Reference Farvestof. Hvis ROX reference farvestof er nødvendige for de Ægte Tid PCR forstærkere at du er for tiden bruger, 50×ROX Reference Farvestof (Kat#10200ES) er anbefales for bruge. I denne sagen, den tilføjet bind er 0,8 μL, som vist i Tabel 1. Hvis bruger andre
mærker af ROX produkter, tak henvise til deres instruktioner for ROX tilføjelse. Hvis ingen ROX reference farvestof er påkrævet, den tilføjet bind er 0 μL.
3） Tilføjelse af skabeloner
- Bland qPCR-blandingen med tilstrækkelig omrystning, centrifuger ved lav hastighed og opsaml restvæsken fra hætten
til bunden af røret.
- Tilføj 20 μL qPCR Bland til hvert reaktionsglas/brønd. Bemærk venligst at tilføje den tilsvarende qPCR Mix til hver
prøverør og undgå at tilføje fejl.
- Tilføj skabeloner til røret/brøndene, som indeholdt qPCR-blandingen. Se tabel 4 for tilføjelse af skabeloner.
| Test prøver | I hvert rør el godt … |
| TS | 20 μL qPCR Mix+20 μL Prøver efter ekstraktion |
| NTC | 20 μL qPCR Mix+20 μL DNA Fortynding buffer |
| NCS* | 20 μL qPCR Mix+20 μL negativ prøve efter ekstraktion* |
| PCS | 20 μL qPCR Mix +20 μL positiv kontrollere |
Tabel 4 skabeloner tilføjer
*Vi anbefaler at bruge DNA-fortyndingsbuffer (40619-E) som skabelon for NCS til DNA-ekstraktion.
**De total reaktion bind i hver rør/brønd er 40 μL.
***Dække de rør låg eller de plade film. Til undgå påvirker de fluorescens signal læs venligst tage omsorg ikke til mærke de rør låg eller film
eller endog gnide de film gentagne gange med -en skraber.
****Centrifuge de reaktion rør eller plade kort på lav hastighed efter skabeloner tilføjer. Efter tilstrækkelig ryster og blanding, gentag centrifuge
på lav hastighed til samle de flydende fra de låg eller væg til de bund. Undgå bobler når operation. De baseline vilje være påvirket hvis de blande
er ikke blandet altså denne trin er meget vigtig til -en god eksperiment resultat.
4）qPCR-programindstilling
- Indstillinger for programfil
Eksempel (7500 Real-Time PCR System instrument og Real-Time PCR Software v2.4):
Instrumenttype: 7500 (96 brønde)
Eksperimenttype: Kvantificering-standardkurve;
Kemi: Taqman®-reagenser
Rampehastighed: Standard (~2 timer for at gennemføre et løb)
- Indstillinger for målkanal
I "Definere Mål og prøver" af "Plade Opsætning", skabe -en Mål 1 kanal (FAM), vælge FAM som de rapportering fluorescensgruppe og MGB eller ingen som slukningen fluorescens gruppe. Skabe -en Mål 2 kanal (VIC), vælge de rapportering fluorescens gruppe som VIC og de slukning fluorescens gruppe som ingen. I "Tildel Mål og prøver" af "Plade Opsætning", hvis ingen ekstra ROX farvestof er tilføjet, vælg "ingen"; Hvis en ekstra ROX er tilføjet, vælg
ROX.
- Standard forstærkningsprogram Indstillinger
| S/N | Reaktionsstadiet | Temperatur | Tid | Cyklus(r) |
| 1 | Indledende denaturering | 95℃ | 5 min | 1 |
| 2 | Denaturering | 95℃ | 15 sek |
45 |
| 3 | Udglødning/forlængelse (fluorescenssignalopsamling) |
62℃ |
30 sek |
Tabel 5 Indstillinger for standardforstærkningsprogram
- Grundlinje og tærskelindstilling:
Princip af baseline justering: bruge de automatisk baseline generelt. Hvis behov til tilpasse i manuel, vælge de cyklus før den eksponentielle vækst periode som startcyklus, og undgå udsvingszonen af initial fluorescens samling. Vælg den cyklus, der er 1-2 cyklusser før Ct for den tidligste eksponentielle amplifikationsprøve som
slutpunkt.
Princip af tærskel justering: brug den automatiske tærskel generelt. Hvis det er nødvendigt at justere i manuel, tærsklen skulle være sæt højere end de Negativ prøve eller de baseline støj, det er generelt sæt tærsklen i de sent
fase af den eksponentielle forstærkning, relativ uafhængig og passende tærskel er nødvendig for hver tunnel.
5) Resultat Analyse
- Resultatbedømmelse for PCS, NTC og NCS:
Hvis IC tilføjet: specifikationen for hver kontrolprøve skal være opfyldt i tabel 6:
| Kontrolprøve | FAM Signal | VIC signal |
| PCS | Ct < 40, og har tydelig amplifikationskurve | Ct < 40 og har tydelig amplifikationskurve |
| NTC | Ct ≥ 40 eller ingen tydelig amplifikationskurve | Ct < 40 og har tydelig amplifikationskurve |
| NCS | Ct ≥ 40 eller ingen tydelig amplifikationskurve | Ct < 40 og har tydelig amplifikationskurve |
Tabel 6 Resultat dom af PCS, NTC og NCS
Hvis IC ikke tilføjet: hver kvalitetskontrolprøve skal opfylde specifikationen for FAM-signalkolonnen i tabel 6, og ingen
nødt til at analysere VIC kanal.
- Resultatbedømmelse for TS
Forudsætning: Det er nødvendigt at afgøre om PCS, NTC og NCS bestået specifikationen i tabel 6 før TS resultatanalyse. Hvis bestået, så kan fortsæt til næste skridt. Hvis ikke bestået, de TS resultater maj ikke være pålidelig, og
årsagen skal undersøges.
Hvis IC tilføjet: find de tilsvarende resultater bedømmelse i henhold til resultatoplysninger fra FAM og VIC i tabel 7:
| FAM Signal | VIC signal | Resultat dom |
| Ct<40 og har oplagt amplifikationskurve | Ct<40 og har tydelig amplifikationskurve | Positiv |
| Ct≥40 eller ingen tydelig amplifikationskurve | Der eksisterer en hæmning, den eksperimentet skal gentages | |
| Ct≥40 eller ingen indlysende amplifikationskurve | Ct<40 og har tydelig amplifikationskurve | Negativ |
| Ct≥40 eller ingen tydelig amplifikationskurve | Der eksisterer en hæmning, den eksperimentet skal gentages |
Tabel 7: Resultat dom af TS (IC tilføjet)
*Hvis der er hæmning for VIC signal, behandling er nødvendige til eliminere de inhibitorer eller gentage de prøve.
Hvis IC ikke tilføjet: find de tilsvarende resultater dom iflg resultatoplysningerne for FAM i tabel 8 , og det er ikke nødvendigt at analysere VIC signal.
| FAM signal | Resultat dom |
| Ct<40 og har tydelig amplifikationskurve | Positiv |
| Ct≥40 eller ingen tydelig amplifikationskurve | Negativ |
Tabel 8: Resultat dom af TS (IC ikke tilføjet)
Noter
- Læs venligst denne vejledning omhyggeligt, før du bruger dette sæt. Forsøget skal udføres på en standardiseret måde, herunder prøvehåndtering, klargøring af reaktionssystem og prøvetilsætning.
- Fortsæt med at tilsætte prøver og forberede reagenser på is, hvis det er muligt.
- Vortex og bland godt for hver reagens før brug.
- Brug venligst laboratoriefrakker og engangshandsker，til din sikkerhed.
- Dette produkt er kun til forskningsbrug.
[1] Zhao F, Wang X, Li Y, Chen X, Geng Z, Zhang C.Effekter af kosttilskud med epigallocatechin gallat på kødkvalitet og muskelantioxidantkapacitet hos slagtekyllinger udsat for akut varmestress. Dyr (Basel). 2021;11(11):3296. Udgivet 2021 18. november. doi:10.3390/ani11113296(IF:2.752)
Betaling og sikkerhed
Dine betalingsoplysninger behandles sikkert. Vi gemmer ikke kreditkortoplysninger og har heller ikke adgang til dine kreditkortoplysninger.
Forespørgsel
Du kan også lide
FAQ
Produktet er kun til forskningsformål og er ikke beregnet til terapeutisk eller diagnostisk brug hos mennesker eller dyr. Produkter og indhold er beskyttet af patenter, varemærker og ophavsrettigheder ejet af Yeasen Biotechnology. Varemærkesymboler angiver oprindelseslandet, ikke nødvendigvis registrering i alle regioner.
Visse applikationer kan kræve yderligere tredjeparts intellektuelle ejendomsrettigheder.
Yeasen er dedikeret til etisk videnskab og mener, at vores forskning bør adressere kritiske spørgsmål og samtidig sikre sikkerhed og etiske standarder.