Vero Host Cell DNA Residue Detection Kit bruges til kvantitativ analyse af Vero værtscelle DNA-rester i mellemprøver, halvfabrikata og færdige produkter af forskellige biologiske produkter.

Dette kit anvender Taqman fluorescerende probe og polymerasekædereaktionsmetoden (PCR), som har fg-niveau minimum detektionsgrænse og kan specifikt og hurtigt detektere det resterende Vero-celle-DNA. Sættet skal bruges sammen med Residual DNA Sample Preparation Kit (Cat# 18461ES).

Produkt Komponenter

^*IC: Intern kontrol

Forsendelse og opbevaring

1. Sendes på tøris og opbevaret ved -20°C for 2 år

2. Efter modtagelse af varerne bedes du straks kontrollere og opbevare dem i den tilsvarende opbevaringstemperatur.

Forsigtig

1. Læs venligst denne vejledning omhyggeligt, før du bruger dette reagens, og eksperimentet bør standardiseres, herunder prøvehåndtering, forberedelse af reaktionssystem og prøvetilsætning.

2. Tilføjelse af prøver og klargøring af opløsninger udføres bedst på is.

3. Sørg for, at hver komponent er fuldstændig vortexet og centrifugeret ved lav hastighed før brug.

4. For din sikkerhed og sundhed skal du bære laboratoriefrakker og engangshandsker til betjening.

5. Dette produkt er KUN til forskningsbrug!

Gældende instrumentmodeller

Inkluder, men ikke begrænset til:

Bio-Rad: CFX96 optisk modul.

Thermo Scientific: ABI 7500; ABI Quant Studio 5; ABI Step OnePlus.

Brug af instruktion

1. Vero DNA-standardfortynding og standardkurvepræparation

Den Vero DNA-kontrol blev gradientfortyndet ved hjælp af den DNA-fortyndingsbuffer, der medfølger i sættet, og fortyndingskoncentrationen er 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL, 30 fg/μL, 3 fg/μL.

Se detaljerede instruktioner nedenfor:

1.1 Tø op Vero DNA-kontrol og DNA-fortyndingsbuffer på is. Efter fuldstændig optøning, vortex forsigtigt for at blande, og centrifuger ved lav hastighed i 10 sekunder.

1.2 Tag seks ud rene 1,5 mL rør, mærket med 3 ng/μL, ①, ②, ③, ④, ⑤, ⑥.

1.3 Tilsæt 90 μL DNA-fortyndingsbuffer og 10 μL Vero DNA kontrol til 1.5 mL mikrofugerør mærket 3 ng/μL, og fortynd til 3 ng/μL. Bland og centrifuger derefter i 10 sek. Underpak den fortyndede DNA-standard, og den kan opbevares på kort sigt (ikke mere end 3 måneder) ved -80°C. Undgå venligst gentagen frysning-optøning.

1.4 Tilføj 90 μL DNA-fortyndingsbuffer til anden rør, og følg derefter proceduren nedenfor for de serielle fortyndinger.

[Noter]:

1. Tre replikatbrønde er nødvendige for hver koncentration. Registreringsområdet er 3 fg/μL-300pg/μL og dette sortiment kan udvides efter behov.

2. For at reducere antallet af gentagne fryse-optøning og undgå kontaminering, anbefales det at opbevare DNA-kontrollen i alikvoter ved -80°C for første gang.

3. Når først optøet, kunne DNA-fortyndingsbuffer opbevares ved 2-8°C i 7 dage, hvis den ikke er brugt i lang tid, skal den opbevares ved -20°C.

4. Sørg for at skabelonen er helt blandet, ryst forsigtigt blandingen i 15 sekunder til 1 min for hver gradientfortynding.

2. Extraction Recovery Control (ERC) forberedelse

Indstil koncentrationen af Vero DNA i ERC efter behov (ERC-prøven blev fremstillet med 3 pg/μL DNA som et eksempel), som følger:

2.1 Tilsæt 100 μL testprøve i et rent 1,5 mL rør, tilsæt derefter 10 μL 3pg/μL Vero DNA Standard (③) og bland godt, markeret som ERC.

2.2 Udfør DNA-ekstraktion af ERC-prøven sammen med testprøverne for at forberede den rensede ERC prøve.

3. Forberedelse af positiv kontrolprøve (PCS) (valgfrit)

Indstil koncentrationen af Vero DNA i PCS efter behov (PCS blev fremstillet med 3 pg/μL DNA som et eksempel), som følger:

3.1 Tilsæt 100 μL 3 pg/μL Vero DNA-standard (③) i et rent 1,5 ml rør, derefter markeret som PCS.

3.2 Udfør DNA-ekstraktion af PCS sammen med testprøverne for at forberede den oprensede PCS.

4. Negativ Forberedelse af kontrolopløsning (NCS).

Indstil den negative kontrol i eksperimentet, de specifikke operationstrin er som følger:

4.1 Tilsæt 100 μL prøvematrix (eller DNA-fortyndingsbuffer) i et rent 1,5 ml rør, derefter markeret som NCS.

4.2 Udfør DNA-ekstraktion af NCS-prøven sammen med testprøverne for at forberede den oprensede NCS-prøve.

5. Ingen skabelonkontrol (NTC) forberedelse

Indstil nej-skabelonen kontrol i eksperimentet, de specifikke operationstrin er som følger:

5.1 NTC kræver ingen prøveforbehandling og kan konfigureres på stadiet med qPCR-detektion af resterende DNA-indhold.

5.2 NTC-prøven i hvert rør eller brønd er 20 μL Bland (dvs. 16 μL Vero qPCR mix + 4 μL Vero Primer&probe mix) + 20 μL DNA-fortyndingsbuffer. Det anbefales at konfigurere tre replikatbrønde.

6. PCR reaktionssystem

[Noter]:

1. Beregn det samlede PCR-reaktionsvolumen ud fra antallet af reaktioner: qPCR Mix =(antal reaktioner+2) × (16+4) μL (inklusive tab af to reaktionsbrønde). Mere end tre replikater for hver prøve anbefales i eksperimentet.

2. Efter at have lukket røret eller forseglet pladen, centrifugeres reaktionsrøret eller pladen ved lav hastighed i 10 sekunder. Efter tilstrækkelig omrystning og blanding i 5 sekunder gentages centrifugeringen for at opsamle væsken fra låget eller væggen til bunden. Undgå bobler under drift.

Se nedenstående tabel for den anbefalede pladeopsætning:

Pladelayoutet inkluderer: 1 NTC (nr skabelon kontrol), 1 NCS (negativ kontrol løsning), 6 STD (standardkurven på 6 standardkoncentrationer), 3 TS (testprøver), 3 ERC (ekstraktionsgenvindingskontrol), 1 PCS (positiv kontrolprøve).Tre replikatbrønde for hver prøve.

7. Retningslinjer for opsætning af et PCR-instrument (2-trins metode)

Følgende instruktioner gælder kun for Thermo ABI 7500 qPCR-instrument (Softwareversion 2.0). Hvis du bruger et andet instrument, se den relevante instrumentvejledning for opsætningsvejledninger.

7.1 Generer et nyt eksperiment, vælg skabelonen for absolut kvantificering eller brugerdefineret.

7.2 I 'Definer'-grænsefladen og 'Targets'-ruden, tilføje et mål og navngivet som FAM, vælg reporteren som 'FAM' og quencheren som 'ingen'.

7.3 I 'Samples'-ruden skal du tilføje alle prøveoplysningerne efter tur. Vælg derefter brøndene, vælg målet og prøverne tilsvarende. Sæt opgaven til Vero DNA-standard som standard, og tildel værdierne 300000, 30000, 3000, 300, 30, 3 (enheden for DNA-koncentration i hver brønd er fg/μL) i kolonnen Kvantitet, og navngiv brøndene STD 1, STD 2, STD 3, STD 4, STD 5, STD 6, tilsvarende. Indstil NTC's opgave som NTC. Indstil NCS, TS, ERC og PCS som ukendt, og navngivet dem i henhold til ovenstående pladelayout tilsvarende. Klik derefter på næste.

7.4 Indstil amplifikationsprogrammet: Indstil reaktionsvolumenet til 40 μL.

8. Analyse af qPCR-resultater

8.1 Systemet vil automatisk give tærskelværdien i Amplifikationsplot-panelet for analyse. Tærsklen givet af systemet er nogle gange for tæt på basislinjen, hvilket resulterer i en stor forskel i Ct mellem replikatbrønde. Du kan manuelt justere tærskelværdien til en passende position og klikke på Analyser. Derefter kan du indledningsvis kontrollere, om amplifikationskurven er normal i Multicomponent Plot.

8.2 På fanen Resultatanalyse skal du gennemgå standardkurve-plottet. Bekræft værdierne for Slope, Y-intercept, R2 og effektivitet. For en normal standardkurve, R²>0,99; 90%≤Eff%≤110%.

8.3 I 'Se brøndbord' rude i Analyse, koncentrationerne af hver prøver er vist i mængde, enheden er fg/μL, enhederne kan konverteres til pg/μL eller pg/ml i analyserapporten.

Manualer