Reactive Oxygen Species Assay Kit bruger det cellegennemtrængende reagens 2',7'-dichlorofluorescin diacetate (DCFDA) til kvantitativ vurdering af reaktive oxygenarter i levende celleprøver. Den lipofile ikke-fluorescerende DCFDA krydser let cellemembranen gennem passiv diffusion efterfulgt af deacetylering. Det deacylerede produkt er et oxidantfølsomt 2',7'-dichlorfluorescein (DCHF). DCHF oxideres senere af ROS til dannelse af DCF. DCF er meget fluorescerende og detekteres ved fluorescensspektroskopi eller flowcytometri med excitation/emission ved 480 nm/525 nm. Rosup, en sammensat blanding, er en ROS-inducer og kan bruges som en positiv kontrol.

Produktkomponenter

Forsendelse og opbevaring

Dette sæt leveres med en ispose. Opbevares ved -20°C uden lys i 1 år. Undgå gentagen frysning og optøning.

Anvendelsesmetode

1. Reagensforberedelse
DCFH-DA-opløsning: Centrifuger kort ved lav hastighed før åbning. Forbered en fungerende DCFH-DA-opløsning ved at fortynde 10 mM DCFH-DA i serumfrit medium for at opnå en slutkoncentration på 10 μM.
[Bemærk]: DCFH-DA kan også fortyndes i medier uden phenolrød. Brug frisklavet DCFH-DA opløsning, langtidsopbevaring af fortyndet DCFH-DA anbefales ikke. Den nøjagtige koncentration af DCFH-DA, der kræves, vil afhænge af den anvendte cellelinje, men et generelt startområde vil være 10-50 μM. For visse celler, hvis fluorescensen af ​​den negative kontrol (uden DCFH-DA-probe) er meget stærk, fortyndes DCFH-DA til 2-5 μM og forkortes inkubationstiden passende.
Rosup-opløsning: Forbered en 100 µM Rosup-arbejdsopløsning ved at fortynde 100 mM Rosup-stamopløsning i serumfrit medium. Generelt kan inkubation med Rosup ved 37 ℃ i 30 min-4 timer i mørke øge ROS markant.
[Bemærk]: Inkubationstiden for Rosup vil afhænge af cellelinjens følsomhed. For eksempel 30 min for Hela og 1,5 time for MRC5. Hvis stigningen af ​​ROS ikke observeres inden for 30 minutter, kan induktionstiden eller koncentrationen øges passende. Hvis ROS stiger for hurtigt, kan induktionstiden eller koncentrationen reduceres passende.
Lægemidler: Forbered lægemidlet af interesse i komplette medier med 10% FBS eller anden passende opløsning til den ønskede koncentration.
2. Anbefalet protokol for adhærente celler
a) Celleforberedelse: Dyrk klæbende celler i standard cellekulturmedier dagen før eksperimentet, så cellesammenløbet når 70 % på tidspunktet for forsøget.
b) Lægemiddelinduktion: Fjern mediet. Overlæg hver brønd med tidligere forberedte serumfrie fortyndede lægemidler og inkuber i det ønskede tidsrum ved 37°C i mørke.
c) (Valgfrit) Positiv kontrol: Overdæk den positive kontrolbrønd med tidligere forberedt Rosup-opløsning og inkuber i det ønskede tidsrum ved 37°C i mørke.
[Bemærk]: For celler med kort stimulationstid (normalt inden for 2 timer), kan proben også indlæses først og derefter tilføje Rosup eller et lægemiddel af interesse.
d) ROS-sondeladning: Fjern alt mediet, og vask cellerne med serumfrit medium 1-2 gange. Overlay hver brønd med tidligere forberedt DCFH-DA-opløsning. Inkuber ved 37 ℃ i 30 minutter i mørke.
e) Fjern mediet og vask cellerne 1-2 gange med serumfrit medium for at fjerne fri DCFH-DA.
3. Anbefalet protokol for suspensionsceller
a) Celleforberedelse: Dyrk suspensionsceller til ca. 1,5 × 105 celler pr. brønd på dagen for eksperimentet.
b) Lægemiddelinduktion: Saml celler i et konisk rør ved centrifugering og resuspender dem i en passende mængde af tidligere fremstillede serumfrie fortyndede lægemidler og inkuber i det ønskede tidsrum ved 37°C i mørke.
c) (Valgfrit) Positiv kontrol: Resuspender de positive kontrolceller med tidligere forberedt Rosup-opløsning og inkuber i det ønskede tidsrum ved 37°C i mørke.
d) ROS-probebelastning: Saml i et nyt rør og vask cellerne ved centrifugering to gange i PBS. Resuspenderede cellerne med tidligere fremstillet DCFH-DA-opløsning med celletæthed på 1 × 106-2 × 107/ml. Derefter inkuberes ved 37 ℃ i 30 minutter i mørke. Vend røret hvert 3.-5. minut for at sikre fuld kontakt mellem sonden og cellerne.
[Bemærk]: Celletætheden bør justeres i henhold til den efterfølgende detektionsmetode. For eksempel til flowcytometri bør antallet af celler i et enkelt rør ikke være mindre end 104/mL eller mere end 106/mL.
e) Saml og vask celler ved centrifugering to gange med serumfrit medium for at fjerne fri DCFH-DA.
4. Fluorescensdetektion og dataanalyse
Fluorescensmikroskopi Måling: Udfør levende cellemikroskopi med et filtersæt, der passer til fluorescein (FITC) ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Mål celler visuelt for lysstyrke og sammenlign mellem kontrol og prøver, eller brug billedanalysemetoder til at sammenligne signaler mellem digitale fotografier af celler.
Flowcytometrimåling: De adhærente celler skal opsamles med trypsin for at fremstille en enkelt cellesuspension; For suspensionsceller opsamles cellerne direkte. Ideelt set bør 10.000 celler analyseres pr. eksperimentel tilstand. Celler bør ikke være for tætte under eksperimentet (<1 × 106 celler/ml). Udeluk affald og isoler cellepopulation af interesse med gating. Ved hjælp af gennemsnitlig fluorescensintensitet bestemmes foldændringen mellem kontrol og behandlede prøver med Ex/Em = 480/525 nm.
Fluorescerende mikroplademåling: Mål pladen med det samme på en fluorescenspladelæser ved Ex/Em = 480/525 nm i slutpunktstilstand i nærvær af medier. Træk blanke aflæsninger fra alle målinger og bestem foldændring fra analysekontrol.

Forsigtig

1. Vask cellerne efter inkubation med DCFH-DA for at reducere baggrundsstøj.
2. Det anbefales at måle fluorescensen så hurtigt som muligt efter inkubation for at undgå mulige fejl.
3. For din sikkerhed og sundhed skal du bære laboratoriefrakker og engangshandsker til operationen.
4. Kun til forskningsbrug!