Puromycin er et aminoglykosid-antibiotikum produceret ved fermentering og metabolisme af Streptomyces alboniger, som dræber gram-positive bakterier, forskellige dyre- og insektceller ved at hæmme proteinsyntesen. Puromycin er effektivt mod E. coli i nogle tilfælde. Mekanismen er den puromycin er en analog af 3'-terminalen af ​​aminoyl-TrNA-molekyler, som kan binde til A-stedet i ribosomet og blive inkorporeret i den forlængede peptidkæde. Efter at puromycin binder til A-stedet, vil det ikke deltage i nogen efterfølgende reaktioner, hvilket resulterer i for tidlig afbrydelse af proteinsyntese og frigivelse af umodne polypeptider indeholdende puromycin ved C-terminalen.

Pac-genet fundet i den puromycin-producerende stamme Streptomyces alboniger koder for en puromycin N-acetyltransferase (PAC), der giver resistens over for puromycin. Denne egenskab er nu almindeligt anvendt til at screene stabilt transficerede pattedyrcellelinjer, der bærer pac-genplasmider.

Den generelle anvendelse af puromycin i udvælgelsen af ​​stabile celletransfektioner er relateret til egenskaberne af lentivirale vektorer. De fleste af de kommercielle lentivirale vektorer bærer nu pac-genet. I nogle specifikke tilfælde kan puromycin også anvendes til at screene for transformationen af ​​E. coli-stammer, der bærer pac-genplasmidet.

Dette produkt er velegnet til cellekultur, almindelig arbejdskoncentration er 1-10 µg/mL.

Yeasen Company leverer desuden puromycin (kat# 60209ES) i opløsningsform, som er i en anden tilstand, men har samme funktion.

Funktioner

Renhed≥98 %

Ansøgninger

Velegnet til cellekultur

Screen-specifikke pattedyr stabilt transficerede cellestammer, der bærer plasmider, der bærer pac-genet

Skærm de transformerede E. coli-stammer, der bærer pac-genplasmidet

Specifikationer

Komponenter

Forsendelse og opbevaring

De suromycin dihydrochlorid produkter skal opbevares ved -15 ℃ ~ -25℃ for 2 år.

Instruktioner

1. Foreslået arbejdskoncentration

Pattedyrceller: 1-10 μg/ml, skal den optimale koncentration bestemmes ved at dræbe kurven.

Escherichia coli: LB-agarmedium blev brugt til at screene Escherichia coli stabilt transformeret med pac-gen i en koncentration på 125 μg/ml.

Note: Screening af stabile E. coli-stammer med puromycin kræver præcis pH-justering.

Anbefalede koncentrationer af puromycin hydrochlorid

2. Opløsningsmetode

Opløs puromycin i destilleret vand for at fremstille en stamopløsning på 50 mg/ml. Efter sterilisering ved filtrering gennem en 0,22 μm filtermembran, aliquot og opbevar ved -25 til -15℃. Alternativt kan det opløses i methanol for at fremstille en opbevaringsopløsning på 10 mg/ml.

3. Bestemmelse af puromycin drabskurve (hvis man tager shRNA-transfektion eller lentivirus-transduktion som eksempel)

Den effektive screeningskoncentration af puromycin er relateret til celletype, væksttilstand, celletæthed, cellemetabolisme og cellecyklusposition. For at screene for stabilt udtrykkende shRNA-cellelinjer er det afgørende at bestemme minimumskoncentrationen af ​​puromycin, der dræber ikke-transficerede/transducerede celler. Det anbefales, at kunder, der laver forsøg for første gang, skal etablere en dræbskurve, der passer til deres eget forsøgssystem.

1) Dag 1: Pladen med 24 brønde udplades med en tæthed på 5-8×104 celler/brønd, og et tilstrækkeligt antal brønde udplades til efterfølgende gradientforsøg. Celler blev inkuberet natten over ved 37°C℃.

2) Dag 2: A) Forbered screeningsmedium: frisk medium indeholdende forskellige koncentrationer af puromycin (såsom 0-15 μg/ml, mindst 5 gradienter); B) Udskift det frisklavede screeningsmedium i cellerne efter inkubation natten over; Derefter inkuberes cellerne ved 37℃.

3) Dag 4: Erstat med frisk selektionsmedium og observer cellelevedygtighed.

4) Afhængigt af cellernes væksttilstand, skift til frisk selektionsmedium hver 2.-3. dag.

5) Celler blev overvåget dagligt for at observere hastigheden af ​​levedygtige celler for at bestemme den laveste koncentration af lægemiddel, der var effektiv til at dræbe ikke-transficerede eller alle ikke-transducerede celler inden for 4-6 dage efter starten af ​​antibiotisk screening.

4. Screening af pattedyr stabilt transficerede cellelinjer

Efter transfektion af plasmidet indeholdende pac-genet blev cellerne propageret i et medium indeholdende puromycin for at udvælge stabile transfektanter.

1) 48 timer efter transfektion dyrkes cellerne (original eller fortyndet) i frisk medium indeholdende en passende koncentration af puromycin.

Bemærk: Antibiotika er mest effektive, når celler aktivt deler sig. Hvis cellerne er for tætte, vil effektiviteten af ​​antibiotika blive betydeligt reduceret. Det er bedst at udplade celler til en tæthed på ikke mere end 25%.

2) Fjern og udskift kulturmediet indeholdende puromycin hver 2-3 dag.

3) Celledannede foci vurderes 7 dage efter screening. Læsioner kan kræve en ekstra uge eller mere, afhængigt af værtscellelinjen og transfektionsscreeningseffektiviteten.

Bemærk: Observer cellevækststatus hver dag. Screening af puromycin kræver mindst 48 timer, og screeningsperioden for effektiv koncentration af puromycin er generelt 3-10 dage.

4) Overfør og anbring 5-10 resistente kloner i en 35 mm petriskål og fortsæt med at dyrke med selektionsmedium i 7 dage. Denne berigelseskultur skal forberedes til fremtidigt cytotoksicitetseksperiment.

Dokumenter:

Sikkerhedsdatablad

60210_MSDS_HB220421_DA.pdf

Manualer

60210_Manual_HB250114_DA.pdf

Citater og referencer:

[1] Furge KA. et al., 2001. Undertrykkelse af Ras-medieret tumorigenicitet og metastase gennem inhibering af Met-receptoren tyrosinkinase. PNAS 98:10722-7.

[2] Díaz J. et al., 2014.Rab5 er påkrævet i metastatiske cancerceller til Caveolin-1-forstærket Rac1-aktivering, migration og invasion. J Cell Sci. 127:2401-6.

[3] Rössger K. et al., 2013. Belønningsbaseret hypertensionskontrol ved en syntetisk hjerne-dopamin-grænseflade. PNAS, 110:18150-5.

[4] Kamer I. et al., 2005. Proapoptotisk BID er en ATM-effektor i DNA-skade-responscellen. 122:593-603.

[5] Charnaux N. et al., 2005. RANTES (CCL5) inducerer en CCR5-afhængig accelereret udskillelse af syndecan-1 (CD138) og syndecan-4 fra HeLa-celler og former.

[6] Gao J, Zhao N, Knutson MD, et al. Det arvelige hæmokromatoseprotein, HFE, hæmmer jernoptagelse via nedregulering af Zip14 i HepG2-celler[J]. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(31):21462-8.

[7] Huang J, Dibble CC, Matsuzaki M, et al. TSC1-TSC2 komplekset er påkrævet for korrekt aktivering af mTOR2[J]. Molecular and Cellular Biology, 2008, 28(12):4104-4115.

[8] Nasser MW, Datta J, Nuovo G, et al. Nasser MW, Datta J, Nuovo G, Kutay H, Motiwala T, Majumder S, Wang B, Suster S, Jacob ST, Ghoshal KNedregulering af mikro-RNA-1 (miR-1) i lungekræft. Undertrykkelse af tumorigene egenskaber af lungekræftceller og deres sensibilisering over for doxorubicin-induceret apoptose af miR-1. J Biol Chem. 283: 33394-33405[J]. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(48):33394-33405.

[9] Paatero AO, Hilkka T, Happonen LJ, et al. Bakteriofag Mu-integration i gær- og pattedyrsgenomer [J]. Nucleic Acids Research, 2008, 36(22): e148-e148.

[10] Zhang D, et al. En ikke-kanonisk cGAS-STING-PERK-vej letter det translationelle program, der er afgørende for senescens og organfibrose. Nat Cell Biol. maj 2022;24(5):766-782. doi: 10.1038/s41556-022-00894-z. Epub 2022 2. maj. PMID: 35501370.

[11] Lu T, et al. CD73 i små ekstracellulære vesikler afledt af HNSCC definerer tumorassocieret immunsuppression medieret af makrofager i mikromiljøet. J Ekstracelle-vesikler. 2022 maj;11(5): e12218. doi: 10.1002/jev2.12218. PMID: 35524455; PMCID: PMC9077142.

[12] Chen S, et al.Identifikation af ubiquitin-specifik protease 32 som et onkogen i glioblastom og de underliggende mekanismer. Sci Rep. 2022 19. april;12(1):6445. doi: 10.1038/s41598-022-09497-y. PMID: 35440702; PMCID: PMC9018837.

[13] Han L, et al. Uterus globulin-associeret protein 1 (UGRP1) binder podoplanin (PDPN) for at fremme en ny inflammationsvej under Streptococcus pneumoniae-infektion. Clin Transl Med. 2022 Jun;12(6): e850. doi: 10.1002/ctm2.850. PMID: 35652821; PMCID: PMC9161880.

[14] Sun Q, et al. MORTALIN-Ca2+-aksen driver medfødt rituximab-resistens i diffust storcellet B-celle lymfom. Cancer Lett. 2022 1. jul; 537:215678. doi: 10.1016/j.canlet.2022.215678. Epub 2022 18. april. PMID: 35447282.