G418 Sulfate, også kendt som Geneticin Sulfate, er et aminoglykosid-antibiotikum og strukturelt ligner Gentamycin B1. Det interfererer med proteinsyntese ved at binde 80'er-ribosomer og blokere forlængelsestrin. G418-sulfat er giftigt for både prokaryote og eukaryote celler, herunder bakterier, gær, højere plante- og pattedyrceller samt protozoer og orme. Resistensgenet (hovedsageligt neo), lokaliseret i transposon Tn601 (903) eller Tn5, er afledt af bakterier, men kan udtrykkes i eukaryote celler. Resistensgenet kan indføres i celler gennem gen-rekombinationsteknikker for at opnå resistens af G418, som kan bruges til at screene og vedligeholde kulturen af ​​prokaryote eller eukaryote celler, der bærer resistensgen.

I pattedyrsceller koder neo, for ekspressionen af ​​amino-glycosid 3'-phosphotransferase (APH (3') II) efter integration i det eukaryote genom. Dette enzym inaktiverer antibiotikummet ved kovalent at modificere amino- eller hydroxylfunktionen af ​​G418 og hæmme interaktionen mellem antibiotika og ribosom, hvilket giver cellen G418-resistens. Ved screening af stabile cellelinjeeksperimenter bør drabskurverne (dosis-responskurver) etableres for at bestemme den minimale effektive koncentration til at dræbe ikke-resistente celler.

I planteceller kan resistens opnås ved transfektion af nptII-genresistent plasmid. nptII-genet koder også for aminoglycosid-phosphotransferase, et enzym, der inaktiverer flere antibiotika, herunder G418, kanamycin og palomycin.

Funktioner

Renhed≥98 %

Standardiseret produktion ved hjælp af fabrikkens masseproduktionstilstand

Bred vifte af applikationer, som kan bruges inden for molekylærbiologi og biokemisk eksperimentel forskning i vævskultur

Samarbejdsplatformen dækker helheden

For at sikre produktkvalitetsstabilitet kontrolleres forskellen mellem batch inden for 1 %

Ansøgninger

Screening af stabilt transficerede cellelinjer

Specifikationer

Komponenter

Forsendelse og opbevaring

De G418 Sulfat (Geneticin) produkter skal opbevares ved -15 ℃ ~ -25℃ for 3 år.

Instruktioner

1. Fremstilling af G418 opbevaringsopløsning (50 mg/ml, aktiv koncentration)

1) Konvertering af aktivitetsenheder

Konvertering blev udført ifølge denne formel: (1000/A0) xA1=A2

A0: Styrkeværdi for G418, som varierer fra batch til batch. Se batchkvalitetsrapporten eller etiketten på flasken.

A1: Koncentrationen af ​​aktiv G418, du ønsker.

A2: Den faktiske koncentration af G418.

For eksempel, hvis G418-aktivitetsværdien for batchen er 750 U/mg, og den aktive koncentration af G418 er 50 mg/ml, er den faktiske pulverkoncentration, der skal fremstilles, 1000/750×50 mg/ml=66,67 mg/ml. Hvis der tilberedes 10 ml G418 opbevaringsopløsning (aktiv koncentration, 50 mg/ml), skal 666,7 mg pulver vejes.

2) Sterilisering og konservering

Vej det faktiske pulver opnået ved ovenstående omdannelse og tilsæt 10 ml sterilt deioniseret vand for at opløse det fuldstændigt.

Forvand 0,22 μm nålefilter med 5 mL sterilt deioniseret vand, og steriliser derefter G418-opløsningen ved filtrering.Alikvoter den steriliserede G418-opløsning og opbevar ved -20 ℃.

Bemærk: ① Filtrer ikke den uklare opløsning, da opløsningen ikke er helt opløst, filtreringsprocessen vil forårsage lægemiddeltab, reducere aktiviteten af ​​den endelige opløsning. ② Det anbefales ikke at bruge dyrkningsmedier, fosfatopløsninger eller organiske opløsningsmidler til at forberede opbevaringsopløsningen.

2. Almindelig anvendt screeningskoncentration

Generelt kræves der initialt en høj koncentration af G418 til screening af transformere og brug en lav koncentration til at opretholde kulturen. Vækstbetingelser, celletyper og andre miljøfaktorer kan påvirke den effektive dosis af G418, så det anbefales at bestemme den optimale screeningskoncentration gennem drabskurven (dosis-respons-kurven).

Generelt er screeningsområdet for pattedyrceller 200-2000 μg/mL, plantecelle: 10-100 μg/mL, Gærcelle: 500-1000 μg/mL.

Cellelinjeeksperimentelle data

3. Etablering af drabskurve

Bemærk: For at screene for cellelinjer med stabil ekspression af målproteiner er det nødvendigt at bestemme minimumskoncentrationen af ​​antibiotika, der kan dræbe utransficerede værtsceller. Dette kan opnås ved at etablere en drabskurve (dosis-respons-kurve). Der skal vælges mindst seks koncentrationer. G418 er mest aktiv ved behandling af mitotiske celler, så celler skal dyrkes i en periode, før G418 tilsættes.

1) Dag 1: Utransformerede celler placeres på en passende kulturplade med en celletæthed på 20-25% ved 37 ℃ og dyrkes natten over i CO₂;

Bemærk: For celler, der kræver højere tæthed for at detektere levedygtighed, kan mængden af ​​podning øges.

2) Indstil G418-koncentrationsgradienten inden for det passende område i henhold til celletypen. Pattedyrceller kan indstilles til 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL.

3) Dag 2: Fjern det gamle medium og erstat det med et frisklavet medium, der indeholder den tilsvarende koncentration af lægemidler. Lav tre parallelle for hver koncentration.

4) Udskift derefter med friske medier indeholdende G418 hver 3.-4. dag.

5) Levende celletællinger udføres i en fast cyklus (f.eks. hver anden dag) for at bestemme den passende koncentration. Vælg minimumskoncentrationen, som dræber størstedelen af ​​celler inden for et ideelt antal dage (normalt 7-10 dage), som arbejdskoncentrationen for stabil transfektionscellescreening.

4. Screening af stabile transficerede celler

1) 48 timer efter transfektion blev G418-kulturmedium indeholdende passende koncentration anvendt til subkultur (direkte subkultur eller fortyndet subkultur).

Bemærk: For at opnå gode screeningsresultater anbefales det at fortynde cellerne med ikke mere end 25% overflod.

2) Skift screeningsmediet indeholdende lægemidler hver 3.-4. dag.

3) Mål cellekolonidannelsen efter 7 dages screening. Kolonidannelse kan tage endnu en uge eller mere, afhængigt af værtscelletype, transfektion og screeningseffektivitet.

4) 5-10 resistente kloner blev udvalgt og overført til 35 mm cellekulturplader og dyrket med lægemiddelholdigt screeningsmedium i 7 dage.

5) Udskift med normalt medium.

Dokumenter:

Sikkerhedsdatablad

60220_MSDS_HB220421_DA.pdf

Manualer

60220_Manual_HB250115_DA.pdf

Figurer

Figur 1.Stabilitetstest og validering af effektiv koncentration af genomycin mellem forskellige batches

Eksperimentel stamme: E. coli

G69 og G99 er to forskellige batcher

Anvendelseskoncentrationen af ​​genomycin blev bestemt til at være henholdsvis 8 mg/L, 12 mg/L og 16 mg/L, og den effektive minimumskoncentration blev bestemt til at være 16 mg/L, hvilket perfekt inhiberede væksten af ​​diverse bakterier. Ydeevnen for de to batches var konsistent.