Hygromycin B, et aminoglycosid-antibiotikum syntetiseret af Streptomyces hygroscopicus, hæmmer proteinsyntesen ved at interferere med 70S ribosomal translokation og inducere fejllæsning af mRNA-skabelon, og dræber således prokaryoter (såsom bakterier), eukaryoter (såsom gærsvampe) og højere svampe fra mammale.

Hygromycinresistensgener (hyg eller hph) afledt af Escherichia coli koder for hygromycin B-phosphotransferase, som afgifter hygromycin B til et ikke-biologisk aktivt phosphoryleret produkt, hvilket gør det til en fremragende selektiv markør til screening og dyrkning af prokaryote eller eukaryote celler, der med succes er transficeret med hytromycin-genresistens. På grund af forskellige virkemåder anvendes Hygromycin B desuden ofte i kombination med G418 eller Blasticidin S til udvælgelse af dobbelt-resistente cellelinjer. Hygromycin B kan også anvendes som et antiviralt middel, fordi det selektivt trænger ind i celler med øget membranpermeabilitet på grund af virusinfektion og hæmmer translation. Det kan også virke insektafvisende via blandet med dyrefoder.

Derudover Yeasen selskab også Hygromycin B (kat # 60224ES) i opløsning form, som er i en anden tilstand, men har samme funktion.

Funktioner

Standardiseret produktion ved hjælp af fabrikkens masseproduktionstilstand

Ansøgninger

Screening af stabilt transficerede cellelinjer

Specifikationer

Komponenter

Forsendelse og opbevaring

De Hygromycin B produkter skal opbevares kl -15℃ ~ -25℃ for 2 år.

Instruktioner

1. Fremstilling af stamopløsningen (50 mg/ml)

Afvej 0,5 g Hygromycin B og tilsæt det til 10 ml af 1×PBS, pH 7,4. Efter grundig opløsning filtreres gennem en 0,22 μm filter for at sterilisere. Alikvoter i små mængder til engangsbrug (f.eks. 1 ml) og opbevar ved -25 til -15℃eller 2 til 8℃.

2. Almindelig anvendt screeningskoncentration

Arbejdskoncentrationen af ​​hygromycin B, der bruges til at screene stabile overførselsstammer, skal variere afhængigt af celletype, medium, vækstbetingelser og cellemetabolisme, med anbefalede koncentrationer på 50-1000 μg/ml. For det første forsøgssystem anbefales en drabskurve (dræbskurve), dosisreaktivitetskurven, for at bestemme den optimale screeningskoncentration.

Generelt pattedyrceller: 50-500 μg/ml; Bakterie-/planteceller: 20-200 μg/ml; Svampe: 300-1000 μg/ml.

3. Etablering af drabskurve

Bemærk: For at screene stabile cellelinjer er det nødvendigt at bestemme minimumskoncentrationen af ​​antibiotika, der er i stand til at dræbe utransficerede værtsceller. Dette kan opnås ved at etablere en drabskurve (dosis-respons-kurve). Der bør arrangeres mindst fem koncentrationer.

1) Dag 1: Utransformerede celler plankes i en passende dyrkningsplade ved en celletæthed på 20-25% og dyrkes natten over.

Bemærk: Mængden af ​​podningsceller kan øges for celler, der kræver højere tæthed for at detektere vitalitet.

2) Indstil koncentrationsgradienten inden for det passende område i henhold til celletypen.Pattedyrcelle kan indstille 50, 100, 250, 500, 750, 1000 μg/ml. Fortynd Hygromycin B-opløsningen 1:10 med deioniseret vand eller PBS-buffer til 5 mg/ml. Og fortynd derefter opløsningen til den tilsvarende arbejdskoncentration i henhold til følgende tabel.

3) Dag 2: Erstat med et frisklavet medium indeholdende den tilsvarende koncentration af lægemidlet. Lav tre parallelle prøver for hver koncentration.

4) Udskift derefter med friske medier, der indeholder medicin hver 3.-4. dag.

5) Udfør levende celletællinger med faste intervaller (såsom hver anden dag) for at bestemme den passende koncentration, der hæmmer væksten af ​​utransficerede celler. Vælg den laveste koncentration, der kan dræbe det store flertal af celler inden for det ideelle antal dage (normalt 7-10 dage) som arbejdskoncentration for stabil transfektantudvælgelse.

4. Screening af pattedyr stabilt transficerede cellelinjer

1) 48 timer efter transfektion blev cellerne subdyrket ved hjælp af screeningsmedium indeholdende hygromycin B i passende koncentration (direkte eller fortyndet).

Bemærk: Antibiotika virker bedst på aktivt delende celler. Hvis cellerne er for tætte, vil antibiotikummet ikke dræbe cellerne. Opdel cellerne således, at cellerne ikke er mere end 25 % sammenflydende.

2) Skift screeningsmediet hver 3-4 dag.

3) Mål cellekolonidannelsen efter 7 dages screening. Kolonidannelse kan tage endnu en uge eller mere, afhængigt af værtscelletype, transfektion og screeningseffektivitet.

4) Udvælg 5-10 resistente kloner og overfør til 35 mm cellekulturplader og dyrk med lægemiddelholdigt screeningsmedium i 7 dage.

5) Erstat med frisk medium uden medicin til dyrkning.

Dokumenter:

Sikkerhedsdatablad

60225_MSDS_HB220420_DA.pdf

Manualer

60225_Manual_HB250115_DA.pdf