Aureobasidin A, også kendt som AbA, Basifungin, breomycin A, er et cyklisk esterpeptidantibiotikum isoleret fra den trådformede svamp Aureobasidium Pullulans nr. R106. Det har en stærk anti-svampeevne og er en hæmmer af den inositolphosphorylerede ceramidsyntase AUR1. Det er giftigt for gær selv ved lavere koncentrationer (0,1-0,5 μg/mL). Svampearter, der er modtagelige for Aureobasidin A, omfatter Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharces pombe, Candida glabrata, Aspergillus nidulans og A. niger. Svampearter, der er modtagelige for det, omfatter tandgær (Saccharomyces cerevisiae), Schizaccharomyces, Schizaccharomyces, glabrata (Candida glabrata), Aspergillus rede (Aspergillus nidulans) og Aspergillus niger (A. niger.). Virkningsmekanismen er, at Aureobasidin A hæmmer aktiviteten af ​​inositolphosphoramidit (inositolphosphorylceramid, IPC) syntase, som svampevækst er afhængig af, og interfererer med sphingolipidsyntese og dræber dermed stammen yderligere. Flere gener, der koder for IPC-syntaser, er blevet undersøgt som AUR 1-genet fra Saccharomyces cerevisiae og AURA-genet fra A. sinensis, som har homologi. Mutning af disse kodende gener gør stammerne resistente over for Aureobasidin A, såsom AUR 1-C genet.

Aureobasidin A er særdeles velegnet som lægemiddelselektionsmarkør til screening af positive kloner. Aureobasidin A-resistens er også en ideel reporter i gær single-hybrid og to-hybrid undersøgelser. Dette produkt er en opløsning af Aureobasidin A opløst i methanol med en koncentration på 1 mg/ml.

Funktioner

Renhed≥97 %

Standardiseret produktion ved hjælp af fabrikkens masseproduktionstilstand

Ansøgninger

Gær to-hybrid undersøgelser

Gær en-hybrid undersøgelser

Strenge markør for valg af gærmedicin

Aureobasidin A-resistens er en ideel reporter til gærhybridiseringsundersøgelser

Specifikationer

Komponenter

Forsendelse og opbevaring

De Aureobasidin A(AbA） produkter skal opbevares kl -15℃ ~ -25℃ for 2 år.

Instruktioner

1. Arbejdskoncentration

Se venligst relevant litteratur for specifik koncentration, og udforsk og optimer i henhold til dine egne eksperimentelle forhold (såsom eksperimentelt formål, celletype, kulturkarakteristika osv.)

2. Celleeksperiment (in vitro eksperiment)

Aureobasidin A standser vækst af gærceller gennem både ceramidforgiftning og fratagelse af essentielle inositolphosphorylceramider^[1].

Triple tandem-gentagelser af hvert CArG-box-motiv blev syntetiseret. Alle DNA-fragmenter blev klonet ind i Y1H-vektoren pAbAi (Clontech, Mountain View, USA) under anvendelse af egnede restriktionssteder. Derefter blev hver samlet pAbAi-konstruktion lineariseret med BstbI og transformeret til Saccharomyces cerevisiae Y1HGold-stamme ifølge Gær Transformation System 2 Manual (Clontech, Mountain View, USA). Kloner, der bar det ønskede DNA-fragment, blev screenet for autoaktivering på syntetisk uracil dropout-medium suppleret med Aureobasidin A i koncentrationen 100–900 ng/ml, som angivet (Clontech, Mountain View, USA)^[2].

De åbne læserammer (ORF'er) af SlBES1 gener blev amplificeret og ligeret ind i pGBKT7-GAL4BD plasmid. Fusions-GAL4BD-SlBES1-konstruktionerne blev yderligere transformeret til Y2H Gold-gærceller. SD/−Trp-mediumplader blev anvendt til at dyrke gærtransformanterne.De α-galactosidaseaktivitet af transformanterne blev identificeret ved X-α-gal og ekspressionen af ​​AUR1-C blev screenet af Aureobasidin A^[3].

3. Minimum hæmmende koncentrationer af Aureobasidin for forskellige gærtyper

4. Driftsprocedurer (til gærtransformationssystem, der er modstandsdygtigt over for AbA)

1) Tilsæt 0,5 ml natten over gærkultur til 50 ml YPD-medium (sammensætning: 1 L flydende medium indeholder 10 g gærekstrakt, 20 g polypepton, 20 g D-glucose; til fast medium tilsættes yderligere 2% agar).

2) Inkuber ved 30℃ 6 timer, indtil OD660 er 1-2. Når du bruger diploider, mål OD660 til at være 2-4.

3) Centrifuger ved 1.000×g i 5 minutter.

4) Resuspender pelleten i 10 mL opløsning A (sammensætning: 100 mM lithiumacetat, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA), centrifuger derefter ved 1.000×g i 5 minutter.

5) Esuspender pelleten i opløsning A, indtil OD660 er 150.

6) Alikvoter 100 µL af cellesuspensionen i et rør og inkuber ved 30°C℃ i 1 time.

7) Tilsæt 5 µg af vektoren (cirkulær eller lineær DNA) og 150 µg Carrier DNA (som er blevet opvarmet til 100℃ i 10 minutter og derefter hurtigt afkølet).

Bemærk: pAUR101 kræver lineært DNA til transformation. Brug af cirkulært DNA vil reducere transformationseffektiviteten eller kan endda mislykkes. pAUR112 og pAUR123 kræver komplet plasmid-DNA til transformation.

8) Tilsæt 850 µL opløsning B (sammensætning: opløs 40 g polyethylenglycol 4000 i 100 ml opløsning A og bland godt, tilbered frisk før brug), og bland forsigtigt.

9) Inkuber ved 30℃ i 30 minutter, derefter ved 42℃ i 15 minutter.

10) Anbring ved stuetemperatur i 10 minutter.

11) Centrifuger ved 5.000 rpm i 1 minut, og resuspender pelleten i 5 mL YPD-medium.

12) Inkuber ved 30℃ i 6 timer til natten over.

13) Centrifuger ved 5.000-10.000 rpm, og resuspender pelleten i 1-10 ml 0,9% NaCl.

14) Plads 100 µL af cellesuspensionen på YPD-selektive mediumplader (indeholdende en vis koncentration af AbA, afhængigt af stammetypen).Inkuber ved 30℃ i 3-4 dage, indtil transformationen er fuldført.

15) Vælg positive transformanter og/eller bestem transformationseffektiviteten (udtrykt som antallet af kolonier transformeret pr. mikrogram plasmid-DNA).

Dokumenter:

Sikkerhedsdatablad

60231_MSDS_HB220420_DA.pdf

Manualer

60231_Manual_HB250116_DA.pdf

Figurer

Figur 1. Vækstdiagram for gærplader

Eksperimentel belastning:GS115

Anvendelsesmængde: 0,05 μg/ml、0,1 μg/ml、0,5 μg/ml、1 μg/ml

Behandling: 3-5 Dags på 30℃

Den øverste række er gærproduktet, og den nederste række er mærket T *.