Diabetes mellitus (DM), una enfermedad metabólica crónica sistémica caracterizada por una elevación crónica de la glucosa en sangre causada por una combinación de múltiples factores de enfermedad, es una epidemia de salud mundial y está relacionada con la genética familiar, factores ambientales, y autoinmunidad. Aunque la DM se conoce desde hace milenios y se han logrado grandes avances en su diagnóstico y tratamiento, actualmente no existe cura para la enfermedad y sus consecuencias para la salud pública no hacen más que aumentar. Por lo tanto, es particularmente importante establecer un modelo animal apropiado de DM y aclarar la patogenia de la DM y sus complicaciones. Los modelos animales de DM que se utilizan habitualmente son la resección quirúrgica del páncreas, la diabetes inducida químicamente, el modelo animal de diabetes espontánea y los animales transgénicos, etc.
Actualmente, el modelo de enfermedad de diabetes inducida por Estreptozotocina (STZ) Se utiliza ampliamente y es adecuado para la observación a largo plazo. La STZ es un compuesto de nitrosourea que, una vez dentro del cuerpo, puede destruir específicamente las células β pancreáticas a través de los siguientes mecanismos:
(1) La inyección de dosis altas de STZ puede provocar que la concentración de coenzima I intracelular (NAD) disminuya en las células β y, por lo tanto, inhibe el metabolismo energético y proteico dependiente de NAD, lo que resulta en la muerte celular;
(2) STZ aumenta el óxido nítrico (NO) producción, que se ha demostrado que participa en el daño de las células β;
(3) Administrada en dosis bajas, la STZ puede desencadenar un proceso autoinmune que conduce a la destrucción de las células β de los islotes pancreáticos: las células β muertas, debido a una dosis baja de STZ, pueden ser fagocitadas por los macrófagos como antígenos para producir factor estimulante de Th1, haciendo que los linfocitos de tipo Th1 sean dominantes. Luego, los linfocitos de tipo Th1 producen IL-2 e IFN-γ, lo que provoca la infiltración de células inflamatorias en el islote y la liberación de IL-1 y TNF-α, IFN-γ, NO y H2Oh2 para matar células, induciendo eventualmente DM.
Biotecnología Yeasen Proporciona una alta tasa de éxito STZ (Cat. n.° 60256ES) para modelado: alta pureza ≥ 98% (HPLC).
1 Procedimiento operativo estándar para la construcción del modelo de diabetes inducida por STZ
1.1 Preparación de animales
Existe un marcado dimorfismo sexual y los machos son más susceptibles a desarrollar diabetes. Como el estrógeno interfiere con la acción de la STZ, las hembras son menos sensibles a la acción diabetogénica de la STZ que los machos. Los estudios han demostrado que las hembras tienen una tasa de modelado deficiente y una tasa de mortalidad más alta que los machos, especialmente el tipo I.
Diabetes tipo I (DM1): Ratas (170-200 g) y ratones (17-22 g) Se recomiendan los siguientes procedimientos: Después de una semana de alimentación adaptativa, se ayunan los animales durante 12 horas y luego se inyecta STZ por vía intraperitoneal, que se puede operar fácilmente y tiene una alta tasa de éxito.
Diabetes tipo II (DM2):Las ratas (de 4 a 5 semanas de edad, peso de 90 a 100 g, por ejemplo, SD o Wistar) y los ratones (de 4 a 5 semanas de edad, peso de 16 a 20 g, por ejemplo, C57, ICR o Kunming) deben ser alimentados con una dieta alta en grasas y azúcar durante 4 a 6 semanas antes de la administración de STZ, y el peso corporal puede alcanzar individualmente alrededor de 240 a 280 g y 30 a 35 g. Se recomienda SD para ratas y C57 para ratones.
1.2 Alimentación animal antes de la administración de la STZ
DM1: Permitir que todos los ratones o ratas tengan libre acceso a la dieta estándar para roedores y al agua durante 1 o 2 semanas de alimentación adaptativa antes del tratamiento con STZ.
DM2: Consumo de una dieta rica en grasas y azúcar para volverla resistente a la insulina antes del tratamiento con STZ.
1.3 Preparación de reactivos
① Dieta rica en grasas y azúcares
La dieta alta en grasas y azúcar se elabora mezclando alimento básico para ratas con sacarosa, grasa de cerdo refinada y yema de huevo en polvo en una proporción de masa: las proporciones son 10% de grasa de cerdo, 20% de sacarosa, 10% de yema de huevo en polvo, 0,5% de colato de sodio y 59,5% de alimento básico.
② Tampón citrato de sodio-STZ
Preparación de la Solución A y la Solución B: Pesar 2,1 g de ácido cítrico (PM: 210,14) y disolverlo en 100 mL de agua bidestilada para preparar la Solución A; pesar 2,94 g de citrato de sodio (PM: 294,10) y disolverlo en 100 mL de agua bidestilada para preparar la Solución B.
Preparación de la solución tampón de citrato de sodio: mezcle las soluciones A y B en una proporción determinada (1:1,32 o 1:1), ajuste el pH a 4,2-4,5 y esterilice mediante filtración utilizando una membrana de 0,22 μm. De esta forma se obtiene la solución tampón de citrato de sodio necesaria; se recomienda prepararla y utilizarla inmediatamente.
Pesar el polvo liofilizado de STZ, colocarlo en un frasco seco y estéril, envolverlo con papel de aluminio y ponerlo en hielo. Agregar solución tampón de citrato de sodio previamente enfriada (1 % p/v) para disolver y esterilizar por filtración utilizando una membrana de filtro de 0,22 μm.
【Nota】① Después de sacar el polvo de STZ del refrigerador, se debe mantener a temperatura ambiente y alejado de la luz durante unos 10 minutos hasta que se descongele por completo. ② Después de pesar, el frasco que contiene la muestra de STZ debe cubrirse con papel de aluminio para protegerlo de la luz, ya que el STZ es inestable. ③ No disuelva el STZ de una sola vez si no es experto en inyecciones. Se recomienda disolver el STZ en grupos de acuerdo con la competencia de la operación. Prepare la solución de STZ para un grupo a la vez, como 10 o 15 ratas/ratones por grupo.
1.4 Inyección de STZ
Administrar la inyección por vía intraperitoneal o en la vena de la cola según el peso en ayunas del animal. En comparación con la inyección intraperitoneal, la inyección en la vena de la cola tiene una mayor eficiencia en la utilización del fármaco, pero es más difícil desde el punto de vista técnico. Si la técnica de inyección no es competente, alternar entre dos grupos para la inyección, y la inyección debe completarse en 30 minutos.
DM1: Para ratones, se recomienda una dosis alta única de 100-200 mg/kg y varias dosis bajas de 20-50 mg/kg durante cinco días consecutivos; para ratas, se sugiere una dosis de 40-70 mg/kg, administrada en una sola inyección.
DM2:Después de una alimentación con una dieta rica en azúcar y grasa durante 1-2 meses, para ratones, se recomienda una dosis de 70-120 mg/kg, administrada en una sola inyección; para ratas, la dosis sugerida es de 25-40 mg/kg, administrada en una sola inyección.
【Nota】Se recomienda realizar un experimento previo para determinar la dosis adecuada de STZ, debido a los diferentes pesos, tolerancia al fármaco, tiempo de ayuno, método de inyección y proceso de alimentación de los animales de experimentación. No realice el experimento a ciegas directamente según la dosis que aparece en la literatura.
1.5 Postinyección
Después de la inyección de STZ, deje que los animales tengan acceso libre a agua y comida. Cambie el relleno todos los días. Mantenga la jaula limpia y seca. Evite la luz solar intensa. Desinfecte con la mayor frecuencia posible.
【Nota】Después de la inyección de STZ, el nivel de glucosa en sangre de los animales mostrará tres fases: hiperglucemia transitoria (1-2 h), hipoglucemia transitoria (6-10 h) e hiperglucemia continua (>72 h). Se debe administrar insulina y glucosa de forma adecuada.
1.6 Remedio de modelado animal
En el caso de los modelos que no cumplen los criterios, se puede administrar STZ adicionalmente una vez que el animal se haya estabilizado (con una inyección intraperitoneal a una dosis de 10-20 mg/kg, eligiendo una dosis adecuada en función de la situación real), o esperar hasta que los niveles de glucosa en sangre vuelvan a la normalidad y luego inyectar a la dosis habitual. Sin embargo, para lograr el efecto deseado, a menudo es necesario reiniciar el proceso de modelado después de volver a un estado normal.
2 Evaluación de DM inducida por STZ modelos animales
① Características generales: pérdida de peso corporal, polidipsia, polifagia y poliuria.
② Glucemia en ayunas (FGB), nivel de insulina sérica (FINS), tolerancia oral a la glucosa (OGT), insulina sérica en ayunas (FSI) y sensibilidad a la insulina.
③ Índices bioquímicos séricos: T-Cho, TG, HDL-C, LDL-C, CR, BUN, Alt, etc.
④ Patología del páncreas: Tinción H&E.
3 Posibles razones del fracaso del modelo de DM inducido por STZ
① Mala calidad de la STZ. La pureza de la STZ para modelado no debe ser inferior al 98 % (detección por HPLC).
② Degradación de STZ. STZ es una solución que se humedece fácilmente y debe mantenerse seca para evitar la humedad. El polvo evita la exposición prolongada a temperatura ambiente y el STZ disuelto es muy inestable, con una vida media de pH neutro de 15 minutos, por lo que debe usarse en su lugar. Disuelva el STZ con un valor de pH ácido, preferiblemente en un baño de hielo.
③ La solución de STZ se inyectó en los intestinos u otros órganos.
Si el modelo no cumple con el estándar DM, se recomienda observarlo durante otros 3 días. Si sigue fallando, repita el procedimiento de inyección.
4 Causas de la alta mortalidad de animales inducida por STZ
① Los animales tienen bajo peso.
② Suministro insuficiente de agua potable.
③ Hiperglucemia o hipoglucemia, generalmente hiperglucemia. Puede aliviarse con una inyección de insulina o con un suplemento temporal de glucosa.
Método de suplementación de insulina: por ejemplo, si se administra Novolin N o NPH (insulina de zinc protamina neutra) 2-3 unidades cada vez, la mortalidad general de las ratas será menor después de 3-5 días.
Método de suplementación de glucosa: La inyección intraperitoneal de glucosa al 20% 4 horas después de la inyección de STZ puede evitar la muerte de ratas debido al bajo nivel de glucosa en sangre causado por el ayuno.
④ Los animales de experimentación se matan entre sí por falta de comida y agua.
⑤ Infección. Los animales con DM son más propensos a contraer infecciones que otros, especialmente infecciones del tracto urinario y abdominales, debido a la poliuria. Es necesario desinfectar antes y después de operaciones invasivas como inyecciones intraperitoneales, inyecciones subcutáneas y extracciones de sangre. Por ejemplo, se puede aplicar tetraciclina (o ungüento oftálmico de aureomicina) en la herida después de cada medición de glucosa en sangre para prevenir infecciones.
5 factores que afectan el modelado de la diabetes
Los factores que afectan al modelo de la enfermedad de la diabetes incluyen la calidad del reactivo de modelado STZ, la condición de los animales y el método de administración. Las principales características de rendimiento del reactivo incluyen pureza, estabilidad y solubilidad. La condición de los animales incluye principalmente antecedentes genéticos, sexo, género, peso, entorno de crianza y estructura dietética. Los métodos de administración incluyen el momento de la administración, los intervalos entre dosis y las vías de administración. Los factores diferenciados producen efectos de modelado diferenciados.
6 Producto arecomendación
| Nombre del producto | Gato# | Especificación |
| 60256ES60 | 100 mg | |
| 60256ES76 | 500 mg | |
| 60256ES80 | 1 gramo | |
| Ácido cítrico, Monohidrato | 60347ES25 | 25 gramos |
| Sal trisódica del ácido cítrico, Dihidrato | 60348ES25 | 25 gramos |
| Disolvente para estreptozocina STZ | 60750ES76 | 500 ml |
[1] Xi Z, et al. Las nanopartículas doblemente modificadas superan las barreras de absorción secuencial para la administración de insulina oral. J Control Release. Febrero de 2022;342:1-13. (PMID: 34864116, SI:7.727)