1. ¿Qué son las células dendríticas (CD)?
Las células dendríticas (CD) son las células presentadoras de antígenos (CPA) más eficaces del cuerpo humano. Las CD son las únicas CPA capaces de estimular de forma robusta la proliferación de células T vírgenes. Otros tipos de CPA (como monocitos, macrófagos, células B, etc.) solo pueden estimular células T activadas o de memoria. Por lo tanto, las células CD son las iniciadoras de las respuestas inmunitarias adaptativas de las células T y desempeñan un papel extremadamente importante en la inmunidad tumoral. Las células CD expresan en gran medida moléculas MHC-I y MHC-II en su superficie y tienen marcadores de superficie específicos. Captan, procesan y estimulan a las células T para activar antígenos y, en última instancia, determinan la dirección de diferenciación de las células T.
2. Fuente de corriente continua (DC)
Las células dendríticas están presentes en cantidades muy pequeñas en el cuerpo. Se necesita mucho tiempo para aislarlas directamente del cuerpo y el rendimiento celular es muy bajo, lo que limita en gran medida la investigación y la aplicación de las células dendríticas. Sin embargo, las células dendríticas se pueden diferenciar e inducir a partir de células precursoras de células dendríticas en diferentes tejidos, como las células precursoras en el líquido de la médula ósea, los monocitos en la sangre periférica y la sangre del cordón umbilical.
En el caso de los seres humanos, dado que la sangre periférica humana es la más fácil de obtener y tiene la mayor cantidad de monocitos, el método más utilizado es inducir las células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDC) a partir de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC). En el caso de los ratones, el método más común es inducir las células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDC).
Figura 1. Diagrama esquemático del método clásico de preparación de BMDC
3. Método de preparación de BMDC
Los métodos comunes para preparar BMDC de ratón son:
3.1 Método clásico de cultivo de BMDC: método Inaba (modificado)
3.2 Preparación a gran escala de BMDC: método de Sons
3.3 Preparación a gran escala de BMDC: método de Lutz
3.1 [Método clásico de cultivo BMDC] - Método Inaba (mejorado)
【Fondo】
a. El número de BMDC obtenidos por el método Inaba es de 5-7 x 106/ratón;
b. El método original de Inaba solo utiliza GM-CSF para inducir la producción de BMDC. Aunque las BMDC obtenidas tienen una fuerte capacidad estimulante en la reacción linfocítica mixta, la madurez de las DC no es tan buena como la de la inducción combinada de GM-CSF + IL-4. Por lo tanto, el método mejorado posterior a menudo utiliza la inducción combinada de GM-CSF + IL-4.
【Pasos de cultivo】
3.1.1 Obtención de células de médula ósea de ratón
1) Los ratones (de 6 a 10 semanas de edad) fueron sacrificados por dislocación cervical, se les extirparon quirúrgicamente todos los fémures y tibias y se eliminó todo el tejido muscular alrededor de los huesos posible con tijeras y fórceps.
[Nota] No dañe los huesos.
2) Mueva el hueso a la mesa limpia y sumérjalo en una placa de cultivo estéril que contenga alcohol al 70% durante 2 a 5 minutos para desinfectarlo y esterilizarlo, luego lávelo dos veces con PBS estéril.
3) Mueva el hueso a otra placa de cultivo nueva que contenga PBS, corte los dos extremos del hueso con tijeras y luego use una jeringa para extraer el PBS. Inserte la aguja en la cavidad de la médula ósea desde ambos extremos del hueso y enjuague repetidamente la médula ósea en la placa de cultivo hasta que el hueso se vuelva completamente blanco.
4) Recoger la suspensión de médula ósea y filtrar los fragmentos pequeños y el tejido muscular con una malla de nailon de 200 mallas.
5) Centrifugar el filtrado a 1200 rpm para 5 minutos y desechar el sobrenadante.
6) Agregue 2 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos de cloruro de amonio (1x), resuspenda las células e incube a temperatura ambiente durante 3-5 minutos, hasta 10 mín.
7) Agregue 10 ml de PBS para neutralizar el efecto del tampón de lisis, luego centrifugue a 1200 rpm durante 5 minutos y desechar el sobrenadante.
8) Lavar una vez con PBS y luego resuspender las células en medio de cultivo RPMI1640 que contenga 10 % de FBS. Se han obtenido células de médula ósea de ratón.
Preparación de solución de lisis de glóbulos rojos con cloruro de amonio:
a. Prepare la solución de almacenamiento 10x de la siguiente manera: pese 82,9 gNH4Cl, 10,0 g de KHCO33 y 0,37 g de Na2EDTA, disolver en 1L de agua destilada, filtrar con 0,22 Membrana de filtro de μm para esterilizar y almacenar a 4 ℃ durante 6 meses;
b. Antes de usar, diluya la solución de almacenamiento 10x con agua destilada estéril 1:9 a 1x solución de trabajo.
[Nota] Debido a que la solución de lisis de glóbulos rojos con cloruro de amonio tiene cierto efecto nocivo sobre las células de la médula ósea, el tiempo de hemólisis debe acortarse lo más posible.
3.1.2 Inducción de la diferenciación de BMDC
1) Cuente las células de médula ósea de ratón obtenidas en el paso 1 y ajuste la concentración celular a 0,5-1× 106/ml con medio de cultivo completo RPMI 1640 que contiene 10% FBS.
2) Coloque en una placa de cultivo de 24 pocillos, 1 ml de células por pocillo, agregue GM-CSF recombinante de ratón (20 ng/ml) y IL-4 (10 ng/ml), y cultivo a 37℃, 5% de CO2 Incubadora. Este es el día 0 de cultivo.
【Nota】
a. Generalmente, alrededor de 4-5x107 Se pueden extraer células de la médula ósea de un ratón, por lo que se pueden sembrar al menos 40-50 pocillos de una placa de 24 pocillos.
b. Los rangos de concentración de GM-CSF e IL-4 son de 20 a 50 ng/ml y 10-40 ng/ml, respectivamente.
3) Agite suavemente la placa de cultivo cada 2 días, luego reemplace 3/4 del volumen con medio de cultivo fresco y reponga las citocinas.
4) Entre el quinto y el octavo día, sople suavemente el medio de cultivo para recoger las células suspendidas y las células ligeramente adheridas.
5) Centrifugadora a 1200 rpm para 5 minutos y desechar el sobrenadante.
6) Resuspender las células en medio de cultivo completo RPMI 1640 que contenga 10 % de FBS y contarlas, luego ajustar la concentración celular a 1×106/ml, y añadir GM-CSF recombinante de ratón (20 ng/ml) y IL-4 (10 ng/ml).
7 ) Coloque las células en placas de cultivo de 100 mm (hasta 10 ml por placa) o en placas de cultivo de 6 pocillos (2 m/pocillo).
8) Continuar cultivando a 37℃, 5% de CO2 incubadora durante 1-2 días.
9) Recoge las células suspendidas, que son las BMDC más maduras.
【Nota】
a. Los pasos 2.5 a 2.8 son pasos de re-recubrimiento, cuyo propósito es hacer que el BMDC obtenido en el paso 2.4 sea más maduro.
b. Dentro de las 3 horas posteriores a la nueva siembra, se pueden observar muchas células adherentes espinosas migrando desde los grupos de DC, y después de 1 día de cultivo, se encontrará que estas células adherentes se desprenden del fondo de la placa de cultivo y se pueden ver muchas DC típicas flotando en el medio de cultivo.
3.1.3 Maduración completa del BMDC
[Nota] Las BMDC obtenidas en el paso 2 no son DC completamente maduras. Si desea obtener DC completamente maduras, aún necesita ser inducida por LPS, CD40L o TNF-a.
1) Centrifugar el BMDC obtenido en el paso 2.4 o 2.9 a 1200 rpm para 5 minutos y desechar el sobrenadante.
2) Resuspender el precipitado con medio de cultivo completo RPMI que contenga GM-CSF recombinante de ratón (20 ng/ml) y IL-4 (10 ng/ml), y ajuste la concentración celular a 1×106/ml después del recuento.
3) Añadir a placas de cultivo de 24 pocillos y añadir inductores de maduración como TNF-α (250 U/mL), LPS (1 μg/mL) o CD40L (1 (μg/ml).
4) Cultivo a 37℃, 5% CO2 incubadora durante 2 días.
5) Recoge las células suspendidas y las células que crecen unidas de forma suelta a la pared, que son células dendríticas maduras.
3.2【Método de producción en masa BMDC】-Método del hijo
【Fondo】
a. Con este método se pueden obtener 30-40×106 DC/ratón en 7 días, lo que es 7-10 veces más que el método clásico de Inaba. Después de centrifugar las DC a través de un gradiente de metrizamida al 14,5 %, la pureza (es decir, células CD11c+/I-Ab+) puede alcanzar el 85-95 %.
b. La capacidad de endocitosis de las DC obtenidas por este método es más débil que la del método clásico de Inaba, pero la cantidad de IL-12p70 secretada es similar.
do. Las DC obtenidas mediante este método tienen una capacidad de estimulación en la reacción de linfocitos mixtos más fuerte que el método clásico de Inaba.
d. Las células DC obtenidas mediante este método pueden inducir una respuesta de células T específicas más fuerte.
mi. En resumen, el método Son puede obtener BMDC más maduros y en mayor cantidad que el método clásico.
【Pasos de cultivo】
3.2.1 Obtención de células de médula ósea de ratón
Vea los pasos correspondientes en el método Inaba (modificado).
3.2.2 Preparación de grandes cantidades de BMDC
1) Cuente las células de médula ósea de ratón obtenidas en el paso 1 y ajuste la concentración celular a 2×105/ml con medio de cultivo completo RPMI 1640 que contiene 10% FBS.
2) Distribuir en placas de cultivo de 6 pocillos, 5 ml de células por pocillo, agregar GM-CSF de ratón recombinante (1000 U/mL) y IL-4 (1000 U/mL), y cultivo a 37℃, 5% de CO2 incubadora.
3) El cuarto día de cultivo, complemente el sistema de cultivo con GM-CSF recombinante de ratón (1000 U/mL) y IL-4 (1000 U/mL).
4) Recoger las células DC el séptimo día de cultivo, resuspender con 2-4 ml de medio de cultivo completo RPMI 1640, añadir a un volumen igual de 14,5 % (p/v) de mepanema y centrifugar a temperatura ambiente durante 20 mín. a 1200xg.
5) Recoger la capa intermedia y lavarla tres veces con medio de cultivo completo RPMI 1640 para su uso posterior.
[Nota] En este punto, el DC es un BMDC inmaduro. Si desea madurarlo aún más, salte al paso 3.
3.2.3 Vencimiento total del BMDC
1) Se volvieron a sembrar los BMDC recolectados en el paso 2.4 y se agregó GM-CSF recombinante de ratón (1000 U/mL) y IL-4 (1000 U/mL), así como LPS (1-10 microgramos/ml) al sistema cultural
2) Cultivado a 37℃, 5% de CO2 incubadora durante 2 días para obtener BMDC maduros.
3.3【Método de preparación de masas BMDC】-Método Lutz
【Fondo】
a. El método Lutz es similar al método Son, y ambos métodos pueden preparar BMDC en grandes cantidades, pero el método Lutz es más ampliamente utilizado que el método Son.
b. Con este método se pueden obtener más BMDC, hasta 1-3 x 108 DC/ratón, y la pureza puede alcanzar el 90-95%;
do. La concentración de citocinas utilizada en este método es mucho menor que la del método Son, solo 200 U/mL, y baja a 30-100 U/mL del octavo al décimo día de cultivo, lo que puede ahorrar en gran medida el costo del reactivo;
d. La mayor diferencia entre este método y el método clásico de Inaba y el método de Son es que las células de la médula ósea se cultivan en una placa de cultivo bacteriano (placa de Petri) en lugar de una placa de cultivo celular. Inaba explicó que la placa de cultivo bacteriano no permite que los macrófagos de la médula ósea se adhieran fácilmente a la pared, lo que inhibe el desarrollo de los macrófagos y evita el efecto inhibidor de los macrófagos en la maduración de las células dendríticas. Esta puede ser la razón principal por la que este método puede obtener una gran cantidad de células dendríticas de médula ósea a una densidad de cultivo más baja.
mi. Sin embargo, el tiempo de cultivo de este método es relativamente largo, requiriendo de 10 a 12 días. Por un lado, esto es para obtener más BMDC. Por otro lado, la mayoría de los granulocitos y linfocitos son difíciles de sobrevivir durante tanto tiempo, por lo que la pureza de los BMDC finalmente obtenidos se puede mejorar;
F. Este método utiliza únicamente GM-CSF para el cultivo de inducción, y las BMDC obtenidas contienen tanto células dendríticas inmaduras como maduras. Para mejorar aún más la madurez, es necesario utilizar LPS o TNF-α durante 1 o 2 días más de inducción, y el contenido de células dendríticas maduras alcanzará el 50-70 %.
【Pasos de cultivo】
3.3.1 Obtención de células de médula ósea de ratón
Consulte los pasos correspondientes en el método Inaba (modificado) y tenga en cuenta que se debe omitir el paso de hemólisis.
3.3.2 Preparación a gran escala de BMDC
1) Cuente las células de médula ósea de ratón obtenidas en el paso 1 y ajuste la concentración celular a 2×105/ml con medio de cultivo completo RPMI 1640 que contiene 10% FBS;
2) Distribuir en placas de cultivo bacteriano de 100 mm (placa de Petri), 10 ml de células por placa, y agregar GM-CSF recombinante de ratón (200 U/mL) y cultivo en incubadora a 37℃, 5% de CO2;
[Nota] Aquí se utilizan placas de cultivo bacteriano, no placas de cultivo celular.
3) El tercer día, añadir 10 ml de medio de cultivo completo que contenga 20 ng/ml GM-CSF de ratón recombinante a la placa de cultivo;
4) El día 6 y 8, cambiar la mitad del medio, es decir, recoger el medio de cultivo antiguo, resuspender el pellet celular con medio de cultivo completo que contenga 20 ng/ml GM-CSF de ratón recombinante después de la centrifugación y luego coloque la suspensión celular nuevamente en el plato original;
5) El día 10 se pueden recoger las células, que son las BMDC.
3.3.3 Maduración completa de los BMDC
1) Recoger las células suspendidas soplando suavemente las DC el décimo día de cultivo con una pipeta y centrifugar a 300xg durante 5 minutos a temperatura ambiente;
2) Desechar el sobrenadante, resuspender el pellet celular con 10 ml de medio de cultivo completo RPMI 1640 y luego extenderlo en una placa de cultivo celular de 100 mm;
3) Añadir GM-CSF de ratón recombinante (100 U/mL) y TNF-α (500 U/mL), o GM-CSF recombinante de ratón (100 U/mL) y LPS (1 (μg/ml);
4) Continuar cultivando a 37℃, 5% de CO2 incubadora durante 1-2 días.
4. Identificación de BMDC
yo Observación morfológica: la mayoría de las BMDC crecen en colonias y las células tienen múltiples protuberancias dendríticas, que son más obvias en las BMDC maduras.
yo Análisis del fenotipo celular: Se utilizó citometría de flujo para detectar la expresión de CD11c, CD40, CD80, CD86, moléculas MHC clase II (IA/IE) en la superficie de las células DC. Las BMDC expresan en gran medida estas moléculas, y la expresión de estas moléculas en BMDC completamente maduras aumentará aún más.
yo Reacción linfocítica mixta (MLR): las BMDC tienen una fuerte capacidad estimuladora y cuanto mayor sea la madurez, más fuerte será la capacidad estimuladora.
5. ¿Cómo elegir un inductor de maduración?
El LPS, el CD40L y el TNF-α son inductores de maduración de uso común y eficaces tanto para las DC humanas como para las DC de ratón. El TNF-α tiene la capacidad más débil para inducir la maduración de las DC entre los tres. El LPS y el CD40L son ambos inductores potentes para la maduración completa de las DC in vitro. La maduración de las DC inducida por ambos es similar, pero el espectro de citocinas inducido es diferente. Las BMDC maduras inducidas por CD40L muestran la capacidad inmunorreguladora más fuerte in vivo, incluida la generación de respuestas inmunitarias protectoras y terapéuticas contra los tumores. La concentración utilizada para estimular la maduración completa de las DC con LPS es generalmente de 1 a 10 μg/mL, pero en realidad 0,1 μg/mL tiene un efecto muy fuerte, pero para fines de seguro, 1 Generalmente se utiliza μg/mL. Cabe señalar que las moléculas CD40L pertenecen a la familia de ligandos TNF, que se caracteriza por el hecho de que solo pueden funcionar después de formar trímeros. Por lo tanto, es mejor utilizar la proteína trímero CD40L recombinante para estimular las DC, lo que tendrá un buen efecto. Si se utilizan monómeros CD40L para estimular las DC, la madurez no es muy alta en la mayoría de los casos.
6. Elección del método de entrenamiento
Tabla 1.Comparación de tres métodos experimentales comunes para preparar BMDC
| Parámetro | Método clásico de cultivo de BMDC: método Inaba | Preparación a gran escala de BMDC: método Son | Preparación a gran escala de BMDC: método de Lutz |
| Número de citas en PubMed | 783 | 24 | 663 |
| Hemólisis de la médula ósea, lisis de los glóbulos rojos. | SÍ | SÍ | No |
| La médula ósea primero elimina los linfocitos | SÍ | No | No |
| Eliminación de granulocitos durante el cultivo. | SÍ | No | No |
| Volumen de siembra inicial de células de médula ósea | 1 ml | 15 ml | 10 ml |
| Incubadora | Placas de cultivo celular de 24 pocillos | Placa de cultivo celular de 6 pocillos | Placa de cultivo bacteriano de 100 mm |
| Medio de cultivo | RPMI 1640 + 10 % de carga de fondo de escala completa | ||
| Concentración de GM-CSF de ratón | 200-1000 U/mL | La concentración inicial añadida es de 125-1000 U/mL El cuarto y séptimo día se añaden cantidades suficientes de GM-CSF e IL-4 al sistema de cultivo. | La concentración inicial añadida es 200 U/mL.3-100 U/mL después del día 10 |
| IL-4 de ratón | No es necesario | Necesidad，La concentración es la misma que la del GM-CSF | No es necesario |
| Método de intercambio de fluidos | El segundo y cuarto día, deseche el 50%-75% del medio de cultivo antiguo (que contiene células) y reemplácelo con medio de cultivo completo nuevo que contenga suficiente GM-CSF. | / | El tercer día se añadió un volumen igual de medio de cultivo completo que contenía GM-CSF. El sexto, octavo y décimo día se reemplazó la mitad del medio. El medio de cultivo antiguo (que contenía células) se aspiró, se centrifugó, se resuspendió en medio de cultivo completo nuevo que contenía GM-CSF y luego se volvió a colocar. |
| Tiempo de cultivo antes del paso (expansión) | 6 días | 7 días | 10 días |
| Tiempo de cultivo después del pasaje (maduración) | 2 días | Ninguno | 1-2 días |
| Inductor de madurez completa | TNF-α（250 U/mL） | LPS (1-10) (μg/ml) | TNF-α（250 U/mL）o LPS(1 (μg/ml) |
| Momento de la recolección de células DC | 7-8 días | 7-8 días | 10-13 días |
| Pureza de CC | Día 8:60-70% | Día 7:85-95% | Día 10-12:80-90% |
| Producción de CC/ratón | (5-7)×106 | (3-4)×107 | (1-3)×108 |
7. Reactivos de cultivo de DC recomendados
| Nombre del producto | Gato | Tamaño |
| 91108ES | 5 microgramos/50 microgramos/100 microgramos/500 microgramos | |
| 90144ES | 5 microgramos/50 microgramos/100 microgramos/500 microgramos | |
| 90621ES | 5 microgramos/20 microgramos/50 microgramos/500 microgramos | |
| 94016ES | 25 microgramos/100 microgramos/500 microgramos |