1. Prefacio
Los macrófagos son fagocitos de gran tamaño que se diferencian de los monocitos en la sangre. Están presentes en casi todos los tejidos, especialmente en aquellos que están en contacto frecuente con el mundo exterior, como la piel, los pulmones y los intestinos. Los macrófagos desempeñan un papel vital en muchos procesos biológicos, como la defensa inmunitaria humana, la respuesta inflamatoria, la reparación de tejidos, la regulación inmunitaria y el desarrollo de enfermedades.
Los macrófagos humanos primarios son difíciles de aislar de los tejidos en cantidades suficientes y no proliferan en cultivos. Los macrófagos derivados de monocitos constituyen una excelente alternativa porque los monocitos de la sangre humana se obtienen fácilmente en grandes cantidades y pueden diferenciarse en macrófagos in vitro.
2.Funciones biológicas de los macrófagos
- Fagocitosis
Los macrófagos reconocen y engullen los patógenos y los restos de células muertas a través de receptores en su superficie. Este proceso no solo ayuda a eliminar la infección, sino que también evita que estas sustancias se acumulen en el cuerpo, lo que podría causar inflamación u otros problemas.
- Defensa antipatógena
Los macrófagos combaten los patógenos produciendo sustancias químicas que matan a los microorganismos, como óxidos reactivos de oxígeno y nitrógeno, así como citocinas y quimiocinas que regulan las respuestas inflamatorias.
- Regulación de la inflamación
Los macrófagos desempeñan un papel complejo en las respuestas inflamatorias. No solo pueden promover la inflamación mediante la liberación de citocinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y la interleucina 1 (IL-1), sino que también pueden inhibirla mediante la producción de citocinas antiinflamatorias como IL-10 y TGF-β.
- Reparación y reconstrucción de tejidos
Tras una respuesta inflamatoria, los macrófagos ayudan a reparar y regenerar los tejidos mediante la secreción de diversos factores de crecimiento. Limpian los restos de daño y promueven la formación de nuevos tejidos.
- Inmunomodulación
Los macrófagos promueven respuestas inmunes específicas al presentar antígenos a las células T. Al mismo tiempo, regulan otros componentes del sistema inmunológico mediante la secreción de diversas citocinas, como la regulación de la actividad de las células T y las células B.
- Relación con las enfermedades
Los macrófagos juegan un papel importante en el desarrollo de muchas enfermedades, incluidas enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes, tumores y enfermedades inflamatorias crónicas como la aterosclerosis.
3. Clasificación de los macrófagos
Según su estado de activación y función, los macrófagos se pueden dividir en dos grandes categorías: M1 y M2. Estos dos subtipos desempeñan funciones diferentes en la respuesta inmunitaria y la regulación de la inflamación.
Macrófagos M1
Los macrófagos M1 son estimulados principalmente por citocinas como el interferón gamma (IFN-γ) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), y tienen características proinflamatorias. Tienen una fuerte actividad antimicrobiana, pueden producir radicales libres de oxígeno y factores inflamatorios, y participan en la eliminación de microorganismos patógenos como bacterias y virus.
Los macrófagos M1 participan en la defensa inmune y la respuesta inflamatoria del cuerpo, promueven la infiltración de células inflamatorias e inmunes, ayudan a limpiar tejidos infectados y dañados y promueven la aparición y el mantenimiento de respuestas inflamatorias inmunes.
Macrófagos M2
Los macrófagos M2 son estimulados principalmente por citocinas como la interleucina-4 (IL-4) y la interleucina-13 (IL-13), y tienen características antiinflamatorias y reparadoras. Participan en procesos de reparación y regeneración tisular, promueven respuestas antiinflamatorias y regulación inmunitaria.
Los macrófagos M2 desempeñan un papel importante en la etapa tardía de la inflamación y la reparación de tejidos, promueven la resolución de la inflamación y la reparación de tejidos, regulan el equilibrio de las respuestas inmunes y promueven la regeneración y reparación de tejidos.
Figura 1. Resumen de los principales estados de polarización de los macrófagos activados [1]
4. Aislamiento, cultivo y diferenciación de macrófagos in vitro
4.1 Método de separación
- Aislamiento de sangre periférica
Aislamiento de monocitos: Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aíslan mediante centrifugación en gradiente de densidad (p. ej., Ficoll-Paque). La muestra de sangre se añade a la capa superior de Ficoll y, después de la centrifugación, los monocitos se ubican entre las capas de plasma y Ficoll.
Aislamiento de macrófagos: después de aislar los monocitos de las células mononucleares de sangre periférica, las células precursoras mononucleares se pueden aislar aún más mediante adhesión plástica. Los monocitos se cultivan en placas de cultivo plásticas durante varias horas, se eliminan las células no adherentes y las células adherentes restantes son principalmente células precursoras mononucleares.
- Aislamiento de tejidos
Las muestras de tejido se descomponen en suspensiones de células individuales mediante un tratamiento mecánico o enzimático (p. ej., colagenasa y DNasa). Las células no diana se eliminan mediante centrifugación en gradiente de densidad o selección negativa (utilizando anticuerpos y perlas magnéticas) y se recogen los macrófagos.
4.2 Método de cultivo
Los medios de cultivo más utilizados son RPMI 1640 o IMDM, que suelen necesitar un complemento con un 10 % de suero bovino fetal (FBS), un 1 % de penicilina/estreptomicina y los factores de crecimiento necesarios. Las condiciones de cultivo suelen ser en una incubadora a 37 °C y un 5 % de CO2.
4.3 Método de inducción de diferenciación
- Diferenciación de células precursoras mononucleares
Uso de M-CSF: Agregue factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) al medio de cultivo, generalmente a una concentración de 20-50 ng/mL, y continúe cultivando durante 7-10 días para inducir la diferenciación de células precursoras mononucleares en macrófagos.
Utilizando GM-CSF: El factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) también puede inducir la diferenciación de los macrófagos, especialmente la tendencia a producir macrófagos M1 (proinflamatorios).
- Regulación adicional del fenotipo y la función.
Macrófagos M1: Se puede inducir añadiendo IFN-γ (interferón-γ) y LPS (lipopolisacárido) al medio de cultivo.
Macrófagos M2: Puede inducirse añadiendo citocinas antiinflamatorias como IL-4 e IL-13.
Estos métodos permiten estudiar las distintas funciones biológicas de los macrófagos y su comportamiento en condiciones patológicas in vitro. Las condiciones operativas específicas de cada paso (como la densidad celular, el tiempo de cultivo, la concentración de factores añadidos, etc.) pueden necesitar ser optimizadas de acuerdo con el propósito específico del experimento.
Tabla 1.Cultivo de macrófagos y condiciones de inducción
| Fuente celular | Medio de cultivo | Adiciones iniciales | Polarización M1 | Polarización M2 |
| Célula THP-1 | RPMI1640 | 100 ng/ml de PMA | 20 ng/ml de IFN-γ 100 ng/ml de LPS | 20 ng/ml de IL-4 20 ng/ml de IL-13 |
| Monocitos | RPMI1640 | M1: 50 ng/ml de GM-CSF M2: 50 ng/mL de LCR-M | 10 ng/ml de LPS 50 ng/ml de IFN-γ | M2a: 20 ng/ml de IL-4 M2b: IgG+LPS M2c: 20 ng/ml de TGF-β1 o 10 ng/ml de IL-10 |
| METROflecha | IMDM | 10-50 ng/ml de LCR-M | 100 ng/ml de LPS (Se pueden añadir 50 ng/mL de IFN-γ) | 10 ng/ml de IL-4 (Se pueden añadir 10 ng/mL de IL-13) |
| REAL ACADEMIA DE BELLAS ARTESW264.7 Célula | DMEM | / | 100 ng/ml de LPS | 20 ng/ml IL-4 (se pueden agregar 20 ng/mL de IL-10） |
5. Datos del ensayo
YEASEN ofrece una serie de productos de citocinas de alta actividad HiActive® relacionados con el cultivo de macrófagos para respaldar la investigación de macrófagos.
Citocinas altamente activas HiActive®:Se ha verificado la actividad biológica de cada citocina para garantizar la alta actividad de la citocina.
Datos de verificación de actividad:
Proteína recombinante M-CSF de ratón
Cifra 1. Medido en un ensayo de proliferación celular utilizando ratón M‑NFS‑60 células linfoblásticas de leucemia mieloide crónica. La DE50 para este efecto es típicamente de 16,74 a 25,83 ng/ml.
Recombinante GM-CSF de ratón Proteína
Cifra 2. El ED50 según lo determinado por un ensayo de proliferación celular utilizando células murinas FDC-P1 es de 2,79-12,84 pg/mL.
Recombinante IL-10 humana Proteína
Cifra 3. La ED50 determinada mediante un ensayo de proliferación celular utilizando Las células MC/9 murinas son inferiores a 0,1 ng/ml, lo que corresponde a una actividad específica de > 1,0×107 UI/mg.
Productos relacionados
| Clasificación | Especies | Gato | Especificación |
| G-CSF | Humano | 2 μg/10 μg/50 μg/100 μg | |
| Ratón | 2 μg/10 μg/50 μg/100 μg/500 μg | ||
|
LCR-M | Humano | 10 μg/100 μg/500 μg | |
| Ratón | 10 μg/100 μg/500 μg | ||
|
FEC-GM | Humano | 5 μg/50 μg/100 μg/500 μg | |
| Ratón | 10 μg/100 μg/ 500 μg | ||
| IFN-γ | Humano | 20 μg/50 μg/100 μg/500 μg | |
| Ratón | 5 μg/50 μg/100 μg/500 μg | ||
| IL-4 | Humano | 5 μg/50 μg/100 μg/500 μg | |
| Ratón | 5 μg/ 100 μg/ 500 μg | ||
| IL-10 | Humano | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Ratón | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | ||
| IL-13 | Humano | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Ratón | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg |
Referencias
[1]Atri C, Guerfali FZ, Laouini D.Papel de la polarización de los macrófagos humanos en la inflamación durante las enfermedades infecciosas. Int J Mol Sci. 19 de junio de 2018;19(6):1801.