1.Antecedentes de la laminina 521
La laminina 521 (LN521) es una proteína de adhesión celular clave en el nicho de las células madre naturales y una matriz para el cultivo y la expansión de células madre pluripotentes inducidas (hiPSC) y embrionarias humanas. La LN521 se une a los receptores de la superficie celular y activa las vías de señalización celular, lo que da como resultado la producción de células más funcionales.
La laminina 521 reproduce el entorno biológicamente relevante de las hPSC in vitro, promueve la adhesión, la alta supervivencia y la fuerte autorrenovación a largo plazo de las hPSC, y es una proteína de matriz clave que respalda el crecimiento de las células madre y mantiene la estabilidad de la estructura y el rendimiento de la membrana basal. La laminina 521 también es una de las matrices de cultivo sin nutrientes más utilizadas. Además, la laminina 521 puede lograr un pasaje eficiente de células madre pluripotentes y genéticamente estables sin la adición de ningún inhibidor de la apoptosis. Las células crecen en una monocapa uniforme sin la necesidad de eliminar manualmente ninguna área de diferenciación. Además, los estudios han demostrado que LN521 puede respaldar el crecimiento de las PSC durante más de 10 generaciones sin ningún signo de anomalías del cariotipo, y mantiene la capacidad de las PSC para diferenciarse en las tres capas germinales: la capa germinal interna, media y externa.
Figura 1. Estructura de la laminina 521 [1]
2. Experimento de recubrimiento de laminina
2.1 Prepare la laminina 521 a 400 µg/ml con agua desionizada estéril o agua para inyección. Se recomienda diluir aún más a 100 µg/ml con DPBS estéril 1× (Ca++/Mg++) antes de su uso y luego diluir a una concentración de trabajo de 5-10 µg/ml con DPBS estéril (Ca++/Mg++). La concentración del recubrimiento varía según el tipo de células cultivadas y se recomienda optimizar el protocolo experimental para determinar la concentración óptima del recubrimiento para las células. Consulte la Tabla 1 para conocer las concentraciones recomendadas.
Nota: DPBS que contiene Ca2+ y Mg2+ Se debe utilizar cationes divalentes, ya que son importantes para la estructura y la función de las proteínas. La concentración de trabajo necesaria de Laminin 521 depende de las células y la aplicación. Recomendamos una concentración de recubrimiento inicial de 0,5 μg/cm2.
Tabla 1. Volúmenes recomendados de solución de trabajo de laminina humana recombinante para diferentes recipientes de cultivo.
| Placa de Petri | Concentración de recubrimiento (μg/mL) | Cantidad adicional de LN521 | Cantidad adicional de 1*DPBS | Volumen total |
| 6 pozo | 5 | 50 μL/pocillo | 950 μL/pocillo | 1 ml/pocillo |
| 12 bien | 5 | 25 μL/pocillo | 475 μL/pocillo | 0,5 ml/pocillo |
| 24 pozo | 5 | 15 μL/pocillo | 285 μL/pocillo | 0,3 ml/pocillo |
| 48 pozo | 5 | 7,5 μL/pocillo | 142,5 μL/pocillo | 150 μL/pocillo |
| 96 pozo | 5 | 3,5 μL/pocillo | 66.5 μL/pocillo | 70 μL/pocillo |
| Placa de Petri de 35 mm | 5 | 50 μL/pocillo | 950 μL/pocillo | 1 ml/pocillo |
| Placa de Petri de 60 mm | 5 | 100 μL/pocillo | 1900 μL/pocillo | 2 ml/pocillo |
| Placa de Petri de 100 mm | 5 | 300 μL/pocillo | 5700 μL/pocillo | 6 ml/pocillo |
El volumen anterior se basa en una concentración de recubrimiento de 5 μg/mL.
2.2 Agregue el volumen especificado de mezcla de laminina y DPBS a cada pocillo y agite suavemente. Asegúrese de que toda la superficie esté cubierta con la solución de recubrimiento de laminina, ya que las superficies sin recubrimiento no favorecen el crecimiento celular.
2.3. Coloque la placa en una incubadora a 37 °C e incube durante la noche. El tiempo mínimo de incubación es de 2 horas, pero se recomienda incubar durante la noche para obtener condiciones ideales de cultivo celular. Tenga cuidado de no dejar que el recipiente de cultivo se seque, ya que esto inactivaría el LN521.
2.4. Cuando las células estén listas para ser sembradas, aspire la solución de laminina 521.
3. Cultivo de células iPSC
3.1 Descongelación de iPSC (tomando como ejemplo una placa de 12 pocillos)
3.1.1 Retire las iPSC del nitrógeno líquido o hielo seco y descongélelas en agua a 37 °C durante 10 segundos.
3.1.2 Esterilice los crioviales con alcohol al 75% y transfiéralos a una superficie de trabajo.
3.1.3 Transfiera las células a un nuevo tubo de centrífuga de 15 mL que contenga 9 mL de DMEM-F12.
3.1.4 Centrifugue el tubo de centrífuga de 15 mL a 300 g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
3.1.5 Deseche la solución de laminina de la placa recubierta de 12 pocillos.
3.1.6 Descarte el sobrenadante celular y resuspenda suavemente las iPSC en 1 ml de mTeSR-plus (que contiene 10 µM de Y-27632) y transfiéralas a la placa de 12 pocillos recubierta. Agite la placa para distribuir uniformemente las células hasta una densidad celular final de 1×10^5 células/pocillo y deje reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Asegúrese de que el cultivo se pase dentro de los 4-5 días.
3.1.7 Devuelva la placa de 12 pocillos a la incubadora a 37 °C para la incubación.
3.1.8 El medio de cultivo que contiene inhibidor de ROCK debe retirarse después de 12 a 16 horas y continuar cultivándose en el medio sin inhibidor.
Tabla 2. Densidad de siembra de células en diferentes recipientes de cultivo, número de células determinado según la tasa de crecimiento celular.
| Recipientes para cultivo celular | 6 pozo | 12 bien | 24 pozo | 96 pozo |
| Número de celular | 2,5 ~ 3,5 × 105 | 6~8×104 | 3~4×104 | 0,5 ~ 1 × 104 |
3.2. Protocolo de transferencia de iPSC
3.2.1 Desechar el sobrenadante del cultivo y enjuagar con 1 mL de PBS (Ca‑‑/Mg‑‑).
Nota: Utilice PBS sin Ca2+ y Mg2+, ya que los cationes divalentes tienen un efecto negativo en algunas enzimas de disociación.
3.2.2 Deseche el PBS y agregue 0,5 ml de reactivo de disociación celular Gentle.Incubar a temperatura ambiente durante 6-8 minutos u observar bajo un microscopio hasta que las células ya no estén unidas a la placa.
3.2.3 Agregue un volumen igual de DMEM-F12, mezcle suavemente las células, transfiera a un tubo de centrífuga a temperatura ambiente y centrifugue a 300 g durante 5 minutos.
3.2.4 Antes de pasar las células, prepare una placa de 12 pocillos recubierta de laminina.
3.2.5 Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en medio mTeSR-plus que contenga 10 micras Y‑27632.
3.2.6 Transfiera las células a la placa de 12 pocillos recubierta de laminina preparada. Agite suavemente la placa para distribuir uniformemente las células y déjela a temperatura ambiente durante 10 a 20 minutos.
3.2.7 Coloque la placa de 12 pocillos en una incubadora a 37 °C e incube.
Nota: Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) se diferencian rápidamente y mueren después de crecer hasta formar una monocapa. Para mantener el crecimiento y la pluripotencia, es necesario realizarles un pase antes de que alcancen la confluencia.
3.3. Criopreservación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC)
3.3.1 Prepare el reactivo de disociación celular suave.
3.3.2 Realice la separación de células de acuerdo con el protocolo de pase de iPSC, utilice el recuento de orgánulos celulares para asegurar la densidad celular antes de la criopreservación.
3.3.3 Cada tubo de células debe congelarse a una densidad celular de 1-2×10^6. Siga los pasos de centrifugación y eliminación del medio de cultivo celular del protocolo de pases de iPSC. Resuspenda el pellet de iPSC aislado en un volumen adecuado de solución de criopreservación.
3.3.4 Agregue 1 mL de pellet de criopreservación de células resuspendidas a un tubo de criopreservación de 1,5 mL, realice un enfriamiento programado y luego transfiera a nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.
4. Notas importantes sobre el recubrimiento de laminina
4.1. Todos los pasos del protocolo experimental deben realizarse en condiciones estériles.
4.2. Evite exponer la laminina a temperatura ambiente durante mucho tiempo.
4.3. Evite la congelación y descongelación repetidas
4.4. Después de la descongelación, la solución madre de proteína sin diluir se puede almacenar a una temperatura de entre 2 y 8 °C en condiciones estériles y se puede conservar de manera estable durante al menos 3 meses.
5. Información relacionada con el producto
| Nombre del producto | Gato# | Tamaño |
| Proteína recombinante humana laminina 521 (libre de origen animal) | 92602ES | 10 μg/100 μg/500 μg/1 mg |
6. Referencias
[1]Pulido D, Briggs DC, Hua J, Hohenester E. El análisis cristalográfico del brazo corto de la laminina β2 revela cómo se inserta el dominio LF en una matriz regular de dominios LE. Matrix Biol. 2017 enero;57-58:204-212.