El valor Ct es una representación de resultado crucial en la PCR cuantitativa fluorescente. Se utiliza para calcular diferencias en los niveles de expresión génica o en el número de copias de genes. Entonces, ¿qué rango de valores Ct se puede considerar razonable en la cuantificación fluorescente? ¿Cómo podemos asegurarnos de que los valores Ct se encuentren dentro de un rango efectivo? Hoy, dejemos que Xiao Yi responda esta pregunta para todos.
¿Qué es el valor Ct?
En el proceso de amplificación por qPCR, el valor Ct se refiere al número de ciclos de amplificación (umbral de ciclo) en el que la señal de fluorescencia del producto amplificado alcanza el umbral de fluorescencia establecido. "C" significa ciclo y "T" significa umbral. En términos simples, el valor Ct es el número de ciclos que necesita la plantilla inicial en qPCR para alcanzar una cierta cantidad de producto, que se explicará más adelante.
¿Cuál es la función del valor Ct?
1. Relación entre la amplificación exponencial, la cantidad de plantilla y el valor Ct
En un escenario ideal, durante la qPCR, los genes se amplifican exponencialmente y se acumulan a lo largo de una cierta cantidad de ciclos. La relación entre la cantidad de ciclos de amplificación y la cantidad de producto se puede expresar como: la cantidad de producto amplificado = cantidad inicial de plantilla × (1 + En) ^ número de ciclos. Sin embargo, las reacciones de qPCR no siempre ocurren en condiciones ideales. Cuando la cantidad de producto amplificado alcanza una "cierta cantidad de producto", la cantidad de ciclos en este punto es el valor Ct, que indica el período de amplificación exponencial. La relación entre el valor Ct y la cantidad inicial de plantilla es la siguiente: existe una relación lineal entre el valor Ct de una plantilla y el logaritmo del número inicial de copias de esa plantilla. Una mayor concentración de plantilla inicial da como resultado un valor Ct menor, mientras que una menor concentración de plantilla inicial conduce a un valor Ct mayor.
2. Curva de amplificación, umbral de fluorescencia y una determinada cantidad de producto
La cantidad de productos de amplificación de qPCR se representa directamente en forma de señales de fluorescencia, lo que se conoce como curva de amplificación. En las primeras etapas de la PCR, cuando la amplificación se realiza en condiciones ideales y el número de ciclos es bajo, la acumulación de productos es mínima y el nivel de fluorescencia producido no se distingue significativamente del ruido de fluorescencia de fondo. Posteriormente, la producción de fluorescencia entra en la fase exponencial. La cantidad de producto de PCR se puede detectar en un punto determinado cuando la reacción está entrando en la fase exponencial, lo que se conoce como la "cantidad de producto determinada". Esto se puede utilizar para inferir el contenido inicial de la plantilla. Por lo tanto, la intensidad de la señal de fluorescencia correspondiente a la cantidad de producto determinada se conoce como el umbral de fluorescencia.
En las últimas etapas de la PCR, la curva de amplificación ya no muestra una amplificación exponencial y entra en la fase lineal y la fase de meseta.
3.La reproducibilidad de los valores de Ct
Cuando los ciclos de PCR alcanzan el número de ciclos en el que se produce el valor Ct, se está entrando en la fase de amplificación exponencial real. En este punto, no se han amplificado los errores menores, por lo que la reproducibilidad de los valores Ct es excelente. Esto significa que, independientemente de que se amplifique la misma plantilla en diferentes momentos o en diferentes tubos al mismo tiempo, los valores Ct obtenidos permanecen constantes.
¿Cuál es el rango de valores de Ct?
1. Eficiencia de amplificación En
La eficiencia de amplificación por PCR se refiere a la eficiencia con la que la polimerasa convierte el gen objetivo en productos de amplificación.La eficiencia de amplificación es del 100% cuando una molécula de ADN se convierte en dos moléculas de ADN. La eficiencia de amplificación se suele denominar En. Para facilitar el análisis en artículos posteriores, a continuación se presenta una breve introducción a los factores que afectan la eficiencia de amplificación.
| Factores influyentes | Explicación | Sentencias |
| A. Inhibidores de PCR | 1. El ARN molde puede contener sustancias que inhiben la reacción de PCR, como proteínas o detergentes, entre otros. 2. El ADNc obtenido después de la transcripción inversa puede contener altas concentraciones de ARN molde y componentes de los reactivos de transcripción inversa, que también podrían inhibir la PCR posterior. | 1. La presencia de contaminación se puede evaluar midiendo las relaciones A260/A280 y A260/A230 o realizando una electroforesis de ARN. 2. Después de la transcripción inversa, si el ADNc se diluye en una determinada proporción. |
| B. Diseño de cebador poco razonable | La imprimación no se puede recocer eficazmente. | Verifique si hay dímeros o estructuras de horquilla en los cebadores y si hay desajustes; a veces es necesario prestar atención al diseño que abarca los intrones. |
| C. Procedimiento de reacción inadecuado | 1. Los cebadores no pueden recocerse eficazmente. 2. La actividad de la ADN polimerasa no se libera completamente. 3. Debido a las altas temperaturas prolongadas, la actividad de la ADN polimerasa disminuye. | 1. La temperatura de recocido es mayor que el valor Tm del cebador. 2. El tiempo de predesnaturalización es demasiado corto. 3. La duración de cada etapa del protocolo de reacción es demasiado larga. |
| D. Reactivos no mezclados completamente o errores de pipeteo | En el sistema de reacción, la concentración local de los componentes de la reacción de PCR es demasiado alta o desigual, lo que da como resultado una amplificación no exponencial de la PCR. | / |
| E.Longitud del amplicón | La longitud del amplicón es demasiado larga, superando los 300 pares de bases, lo que da como resultado una baja eficiencia de amplificación. | Compruebe si la longitud del amplicón está entre 80 pares de bases y 300 pares de bases. |
| F. El impacto de los reactivos qPCR | Una concentración menor de ADN polimerasa en los reactivos o concentraciones de iones subóptimas en el tampón hacen que la enzima Taq no alcance su actividad máxima. | La curva estándar se utiliza para medir la eficiencia de amplificación de los cebadores. |
2. El rango de valores de Ct
El rango de valores de Ct es de 15 a 35. Un valor de Ct menor de 15 se considera que está dentro de la fase basal y no ha alcanzado el umbral de fluorescencia. Idealmente, existe una relación lineal entre el valor de Ct y el logaritmo del número de copias inicial del molde, que se conoce como la curva estándar. Usando la curva estándar, cuando la eficiencia de amplificación es del 100%, el valor de Ct para cuantificar una sola copia del gen se calcula en alrededor de 35. Si el valor de Ct es mayor de 35, teóricamente, el número de copias inicial del molde es menor de 1, lo que puede considerarse estadísticamente insignificante.
Para diferentes genes, el rango de valores Ct, debido a las variaciones en la cantidad de copias de genes de la plantilla inicial y la eficiencia de amplificación, requiere la creación de una curva estándar para ese gen para calcular el rango de detección lineal del gen.
3.Factores que afectan los valores de Ct
Como lo indica la relación entre la cantidad de ciclos de amplificación y la cantidad de producto: Cantidad de producto de amplificación = Cantidad de plantilla inicial × (1 + En)^número de ciclos, se puede ver que en condiciones ideales, la cantidad de plantilla inicial y En afectarán el valor Ct. Las diferencias en la calidad de la plantilla o la eficiencia de amplificación pueden hacer que el valor Ct sea demasiado alto o demasiado bajo.
4. Los valores de Ct son demasiado altos o demasiado bajos
Xiao Yi consultó a los expertos del departamento técnico de nuestra empresa y resumió las causas y soluciones para los dos tipos comunes de problemas con los valores Ct para iluminar a nuestros lectores.
| Problema | Causas | Soluciones |
| Valor Ct demasiado alto | La concentración de plantilla es baja o hay inhibidores de PCR presentes. La eficiencia de amplificación es baja. | 1. Aumente la concentración de la plantilla; o aumente la relación de dilución de ARN o ADNc; o prepare la plantilla nuevamente. 2. Baje la temperatura de recocido o utilice un método de amplificación de dos pasos; asegúrese de que los componentes y el sistema estén bien mezclados; optimice el protocolo de reacción o intente reemplazar los reactivos. |
| Valor Ct demasiado bajo | 1. Alta concentración de plantilla 2. Contaminación en NTC (Sin control de plantilla) y NRC (Sin control inverso) 3. Diseño inadecuado del primer | 1. Reducir la cantidad de ARN molde o diluir el ADNc en una proporción mayor. 2. Reemplace todos los reactivos nuevamente o utilice reactivos anticontaminación UDGase. 3. Optimizar el procedimiento para evitar la amplificación no específica. |
Con esto concluye el análisis de las causas del valor Ct anormal de este problema. A continuación, Xiao Yi recomendará una gama de productos rentables para garantizar que sus datos experimentales sean más precisos y confiables. ¡Ven y elige tus favoritos!
| Nombre del producto | Gato# | Tamaño |
| Mezcla maestra universal azul qPCR SYBR Green de Hieff UNICON™ | 11184ES08 | 5 x 1 ml |
| SuperMix de síntesis de ADNc de primera hebra Hifair™ Ⅲ para qPCR (digestor de ADNg plus) | 11141ES60 | 100 toneladas |
| Supermix de digestión RT-gDNA de un solo paso Hifair™ AdvanceFast para qPCR | 11151ES60 | 100 toneladas |
| Kit de síntesis de ADNc de primera hebra Hifair™ AdvanceFast (sin colorante) | 11150ES60 | 100 toneladas |